גישות חדשות לגלוי המגוון העצום של מיקרואורגניזמים של הקרקע
מבוא
מאז ומעולם סיפקו מיקרואורגניזמים מהטבע תוצרים ביולוגים שימושיים לאדם. חומרים שהם מטבוליטים משניים של מיקרואורגניזמים משמשים ברפואה, בתעשייה ובחקלאות. בין החומרים האלה אנו מוצאים תרופות אנטיביוטיות, תרופות לטיפול בסרטן, חומרים אנטי פטריתיים, חומרים המדכאים תגובות חיסון, אנזימים, מעכבי אנזימים, מדבירי עשבים, מדבירי חרקים וגורמי גידול.
רוב המטבוליטים המישניים בהם אנו משתמשים כיום מקורם במיקרואורגניזמים החיים בקרקע ובמיוחד אקטינומיצטים (Actinomycetes). יצרנים אחרים של חומרים טיבעיים שימושיים הם מיני בצילוס (Bacillus), מיקסובקטריה (Myxobacteria) ופסוידומונס (Pseudomonas). כיוון שמיקרואורגניזמים מהקרקע הם המקור העיקרי לחומרים טבעיים, הרי שרוב המיקרואורגניזמים שבודדו וגודלו במעבדה כבר נבדקו, ונמצא אם ביכולתם לייצר חומרים מועילים לאדם. אך מגוון המיקרואורגניזמים שבטבע עדיין איננו מוכר במלואו, וקרוב לוודאי כי קיימים מיקרואורגניזמים לא-ידועים רבים המייצרים חומרים מועילים. לפיכך שבו הביולוגים לחקור את המיקרואורגניזמים שבקרקע ואת תוצריהם, וזאת לא על-ידי בידודם וגידולם, אלא דווקא בעזרת גישות חדשות, המאפשרות להם לאתר תוצרים מבלי לבודד את החיידקים ולגדלם תחילה.
מבט מקיף על שונותם של מיקרואורגניזמים
חקר המיקרואורגניזמים והחיפוש אחר מטבוליטים משניים נשענים על ההנחה, שגידול בתרבית מאפשר לנו לקבל את רוב המיקרואורגניזמים שבדגימה. ואכן, עד לאחרונה השתמשו רק בגישה זו כדי לחקור מיקרואורגניזמים בדגימות קרקע. אולם מסתבר, כי גידול מיקרואורגניזמים מדגימה בתרבית לא נותן את התמונה כולה, וכי כאשר נוקטים שיטה זו מחמיצים חלק ניכר מהמגוון הקיים בפועל.
כאשר מתבוננים במיקרוסקופ באוכלוסיית המיקרואורגניזמים שבדגימה טבעית, ומשווים את המגוון שנמצא בתצפית למגוון המתקבל אחרי גידול בתרבית, מוצאים כי ההתבוננות במיקרוסקופ מגלה כי מספר הפרטים שנראה במיקרוסקופ גדול בסדר גודל אחד או שניים לפחות ממספר המושבות שגדלו בתרבית. מכאן אפשר להסיק, שגידול בתרבית מגלה רק כ- 1% של התאים שבדגימה.
הועלו כמה השערות המסבירות את האנומליה הזאת: האחת גורסת כי תאים שאי-אפשר לגדל בתרבית הם מיקרואורגניזמים הדומים או זהים מבחינה פילוגנטית לתאים הגדלים בתרבית, אך מצבם הפיזיולוגי מונע מהם להיקלט בתרבית. על פי השערה אחרת, התאים הנראים במיקרוסקופ ואינם גדלים בתרבית שונים פילוגנטית מהמיקרואורגניזמים הניתנים לגידול, ואינם בני-גידול במצעי הגידול ובתנאי הגידול המקובלים. לפי השערה זו, קיים בטבע עושר אדיר של מיני מיקרואורגניזמים אשר עדיין אינם מוכרים למיקרוביולוגים.
כיום נערכים כמה וכמה מחקרים שמטרתם לזהות את המיקרואורגניזמים שאינם בני-גידול. החוקרים משתמשים בשיטות מולקולריות כדי לזהות את המיקרואורגניזמים האלה, וללמוד על בתי-הגידול שלהם ועל התפקיד שאותו הם ממלאים בסביבה.
שיטות לזיהוי מגוון מיקרואורגניזמים בטבע עם דגש על חקר המיקרואורגניזמים שבקרקע
חקר המיקרואורגניזמים בטבע מסובך וקשה בגלל גודלם הזעיר ומבנם הפשוט. שיטות המחקר המקובלות מתבססות על גידולם בתרבית, והתוצאה היא שמיעוט מקרב המיקרואורגניזמים מוכר לנו היטב, ואילו רבים אחרים לא נחקרו כלל. מחקרים עכשוויים מתמקדים בשיטות העוקפות את המגבלה של גידול בתרבית, ומציירות תמונה נכונה יותר של מגוון המיקרואורגניזמים בסביבתם הטבעית.
אחת השיטות הראשונות ששימשו למיון מיקרואורגניזמים היתה חקר הרצף של הגנים המקודדים ל-RNA הריבוזומי (16S rRNA). שיטה זו חוקרת את השונות הפילוגנטית של קהילות מיקרואורגניזמים, והניבה תוצאות דומות בכמה בתי-גידול: התגלו הרבה מיני רצפים חדשים, שלא נמצאו במאגרי המידע עד אז.
בדיקת רצף הבסיסים של הגנים המקודדים ל-RNA הריבוזומי 16S, ושיטות מולקולריות אחרות המשמשות לבדיקת השונות הפילוגנטית, בוחנות את רצף הבסיסים של גנים בודדים. שיטות אחרות, כגון שיבוט, מתמקדות בהבנת השונות התפקודית של מיקרואורגניזמים בטבע:
| טבלה 1: שיטות לבחינת מגוון מיקרואורגניזמים |
|---|
| שיטה | הערות |
|---|
| גידול בתרבית | אינו מייצג |
| קביעת רצף הבסיסים של גנים ל-16S rRNA | מצריכה שיבוט: מאפשרת זיהוי של המיקרואורגניזמים המרכיבים את האוכלוסיה |
| ניצול סובטרט | בודק שונות מטבולית |
| PCR או שיבוט ובדיקת ביטוי גנים | מתמקד בבדיקת תיפקוד |
| סיפריות BAC | שימור מידע גנטי מדגימות, בחינת שונות תיפקוד ומבנה גנטי |
מדידת הפלואורסצנטיות של תאים מסומנים
(flow cytometry) | ספירה של מיקרואורגניזמים |
פולימורפיזם של אורך קטעי הגבלה
restriction fragment length
polymorphism (RFLP) | בדיקה השוואתית |
חשוב לשלב בין כמה שיטות, וכך לבדוק כמה רמות של שונות. כאשר חוקרים מיקרואורגניזמים בדגימת קרקע, חשוב להשתמש במגוון שיטות, כדי לקבל תמונה מלאה יותר של ההבדלים בין המיקרואורגניזמים שבה.
אנליזת DNA של קהילות
מחקרים חלוציים בחנו את השונות של קהילות מיקרואורגניזמים בטבע באמצעות ניסויים של הפרדה וחיבור מחדש של DNA של (DNA-DNA reannealing ) במחקרים אלה מבודדים את כל ה-DNA שבדגימת קרקע באמצעות סרכוז דיפרנציאלי. בדיקות החיבור מחדש הראו כי ה-DNA שבודד ישירות מהקרקע היה מורכב יותר מהצפוי, ומורכבותו מלמדת שהיו בדגימה אלפי גנומים שונים זה מזה. אנליזה דומה של 206 חיידקים שבודדו וגודלו בתרבית מאותה דגימה הראתה שונות פחותה בהרבה. תוצאות הניסויים האלה מלמדות, שבגרם אחד של קרקע עשויים להימצא אלפי מיני חיידקים שאי-אפשר, ככל הנראה, לגדלם בתרבית. ניסויים אלה מעידים, כנראה, על קיומו של מגוון אדיר של מיקרואורגניזמים, שעדיין לא תועד כראוי.
שיטות המבוססות על RNA ריבוזומי (rRNA) מסוג 16S
שיטות רבות לחקר השונות של מיקרואורגניזמים מבוססות על בחינת רצף הבסיסים של גנים המקודדים ל-rRNA 16S. לאחר שמבודדים DNA מדגימות שמקורן בסביבה, מגבירים את רצפי הגנים המקודדים ל-rRNA 16S שבדגימה, ובודקים את הרצפים המוגברים בכמה שיטות, וביניהן שיבוט וקביעת רצף, תספיג נקודתי (dot blot) ועוד. מחקרים מסוג זה סיפקו את ההוכחות המשכנעות ביותר כי אוכלוסיות המיקרואורגניזמים בטבע צופנות בקרבן הפתעות למכביר.
מגבלותיהן של השיטות הקיימות
לשיטות המולקולריות, ובעיקר לאלה המתבססות על תגובת השרשרת של הפולימרז (polymerase chain reaction, PCR), יש מגבלות. אחת המגבלות מקורה בכך, שבמחקרים רבים משווים רצפים של DNA שהתקבלו מדגימות קרקע מהסביבה עם מאגרי מידע קיימים, וכאשר אין התאמה בין הרצפים לבין הרצפים המתועדים במאגר, מסיקים מכך שהמיקרואורגניזם לא בודד ולא גודל בתרבית. מסקנה שכזו מתעלמת מהעובדה שרצפי הגנים של rRNA 16S נקבעו רק לכמחצית מהזנים שבודדו וגודלו בתרבית, וקיימים מיליוני זנים המוחזקים באוספים, שמידע כזה עליהם עדיין אינו קיים. ייתכן אפילו שיש מיקרואורגניזמים שבודדו ורצפי ה-rRNA 16S שלהם נקבעו, אך לא במדויק. החוקרים מבינים כיום, כי יש לזהות את המיקרואורגניזמים לא רק על סמך רצף הבסיסים של הגנים המקודדים ל-rRNA 16S, אלא גם על סמך מאפיינים ביוכימיים ופיזיולוגיים.
מגוון המיקרואורגניזמים שבקרקע: ארץ לא-נודעת
שתי הגישות לזיהוי מיקרואורגניזמים, זו המתבססת על גידול בתרבית וזו המסתמכת על שיטות מולקולריות, תומכות בהנחה כי הקרקע היא בית-גידול עשיר מאוד במיקרואורגניזמים שונים. בדומה לבתי-גידול ימיים ולמעיינות חמים, הקרקע היא מוקד למחקרים מולקולריים ואקולוגיים. אפילו סביבות שלא ציפו למצוא בהן מגוון גדול של מיקרואורגניזמים, כמו חפירות ואתרים מזוהמים, הניבו שונות גדולה מהמצופה. חוקרים אוספים דגימות קרקע מסביבות שונות: יערות, שטחי מרעה, חפירות, טונדרה, שטחים חקלאיים, יערות גשם, חורשות ועוד. הפיזור הגיאוגרפי מגוון גם הוא: אוסטרליה, ברזיל, בריטניה, קנדה, יפן, גרמניה, הולנד, סקנדינוויה, סקוטלנד, סיביר וארצות-הברית הן רק חלק מרשימה ארוכה של מדינות ואזורים שבהם נערכים מחקרים בתחום.
מחקרים מולקולריים הראו כי בדגימות קרקע נמצא מגוון הכולל מינים שונים של פרוטאובקטריה (Proteobacteria), ציטופגה (Cytophgales) ואקטינובקטריה (Actinobacteria). המינים החדשים של אקטינובקטריה הם חשובים במיוחד, מאחר שהם מוכרים כיצרנים של חומרים אנטיביוטיים.
להפתעתם, גילו החוקרים בקרקע גם חיידקים השייכים לחטיבות שאינן נמצאות בקרקע בדרך-כלל, כמו פלנקטומיצטים (Planctomycetes) וספירוכטות (Spirochetes). חיידקים מקבוצת ההולופגה-אצידובקטריום (Holophaga-Acidobacterium) נמצאו כמעט בכל דגימות הקרקע שנחקרו, שמקורן בבתי-גידול הפזורים בארבע יבשות. חיידקים מחטיבה זו זוהו כמעט רק באמצעות בדיקות מולקולריות, כי רק מעטים מהם הצליחו לגדול בתרבית.
לגלות את הנסתר
היכולת לגלות מיני מיקרואורגניזמים חדשים מעוררת סקרנות ותהיות, ונשאלת השאלה – כיצד ניתן ללמוד עוד על יצורים אלה אם איננו מסוגלים לגדלם בתרבית? החוקרים מנסים לפתור את הבעיה בשתי גישות שונות, ששתיהן מתבססות על מיצוי ישיר של DNA מדגימות קרקע:
גישת המגה-גנום
גישת המגה-גנום (megagenome approach), שמקורה במחקרים באיקריוטים, עושה שימוש בנשא BAC (bacterial artificial chromosome) שאפשר לשבט בו מקטעים גדולים של DNA. את ה-DNA המופק מדגימת קרקע קוטעים למקטעים גדולים, משבטים אותם ב-BAC, ומחדירים אותם למאכסן הוותיק, הלוא הוא מיודענו Escherichia coli. כך מתקבלות ספריות של DNA המשובט בחיידקי E. coli. כעת בודקים אם החיידקים מבטאים פנוטיפ חדש כלשהו. שיטה זו נוחה במיוחד לגילוי חומרי טבע חדשים, למשל חומרים אנטיביוטיים חדשים או מטבוליטים משניים אחרים. גנים האחראים לביוסינתזה של מטבוליטים משניים מקובצים, בדרך-כלל, ביחד. קטע ה-DNA המשובט בפלסמיד BAC אחד הוא ארוך דיו לכלול את מסלול הביוסינתזה של מטבוליט משני בשלמותו. זאת ועוד, מכיוון שהמסלול מבוטא בחיידק E. coli, שהמטבוליזם שלו מוכר וידוע, הרי זה קל יחסית להתערב ולשנות שלבים במסלול הביוסינתזה.
שיטת ספריות ה-BAC מאפשרת לחוקרים לבדוק גם היברידיזציה עם גלאים ידועים וזהות רצפים. השימוש בספריות BAC מאפשר לחוקרים לבחון את כל התוכן הגנטי של האוכלוסייה שבדגימה, ולקבל מושג כלשהו על התפקוד והפיזיולוגיה של המיקרואורגניזמים שבדגימה.
גישת השיבוט והביטוי
על פי גישת השיבוט והביטוי (expression-cloning approach) יש למצות את ה-DNA מדגימת קרקע, לקטוע אותו למקטעים קטנים, ולשבט אותם בפלסמיד המתבטא במאכסן במספר גדול של עותקים (high copy number plasmid expression vector). אחר-כך יש לבדוק אם המאכסן מייצר אנזימים העשויים להביא תועלת בתעשייה הקונוונציונלית או בתהליכים ביוטכנולוגיים. בשיטה זו משתמשים בעיקר כדי להפיק אנזימים חדשים ממיקרואורגניזמים מבלי לגדל אותם תחילה.
 |
הסבר לאיור: השוואה בין גישת המגה-גנום לגישת השיבוט והביטוי.
חצים אופקיים מייצגים גנים, והאות P מייצגת מקדמים (promoters). |
סיכום
השונות האדירה של מיקרואורגניזמים בטבע, והשיטות המאפשרות לנו לחקור וללמוד אותם, מביאות אל סף דלתנו מקור עשיר לחומרי טבע חדשים. שימורו של אוצר זה הוא אתגר שעלינו להתמודד עמו. אם מינים מסוימים של מיקרואורגניזמים אינם נפוצים אלא מוגבלים לבתי-גידול מסוימים, היכולת לזהות אותם הופכת להיות חשובה וגורלית. מאחר שהידע על תפוצתם של מינים שונים הוא מוגבל, אנו חייבים להמשיך במחקר ולהגן על המשאבים הקיימים, כדי לשמר את המערכות הטבעיות ולא לפגוע בה
פורסם באתר אורט
תרגמה ועיבדה: רות לומניצר
לפי
M.R. Rondon, R.M. Goodman and J. Handelsman (1999), The Earth Bounty: Assessing and Accessing Soil Microbial Diversity, Trends in Biotechnology 17, 403-408
.jpg)
