יום שישי, 21 ביוני 1996

ספגת המוח - איתן ישראלי וינינה גיטלמן


לאחרונה עלתה שוב לכותרות קבוצת מחלות נדירות בבני אדם ובבעלי חיים, ובראשן "מחלת הפרה המשוגעת". המדובר במחלות, שפוגעות בכבשים וצאן ומ-1986 החלה להופיע בשכיחות גבוהה יחסית בבקר באנגליה. יותר מ-200 עדרים נמצאו פגועים בסוף 1988, ובשנים האחרונות אובחנו יותר מ-140,000 מקרים (למעלה מ-1000 מקרים לחודש). באנגליה נקראת המחלה בלשון העם מחלת "הפרה המשוגעת", ונגרמת כנראה ע"י הזנת הבקר בבשר ועצמות של כבשים המזוהמים ב-Scrapie, 


המחלה שיכת לקבוצת המחלות Transmissible Spongiform Encephalopathies הכוללת את Creutzfeldt-Jacob Disease (CJD), Gerstmann Straussler Syndrom (GSS), Scrapie, Kuru ו-Fatal famalial insommia (FFI). מחלות דומות פוגעות במינק, צבאים, טיגריסים ואלק המוחזקים בשבי.

המחלות האלה הנן מחלות נווניות של מערכת העצבים המרכזית. הסימנים בתאי העצב מתבטאים בהופעה מתקדמת של חללים בשלוחות הדנדריטים והאקסונים, בתא עצמו, ובתאי לואי, עם גידול יתר של תאי גליה, ספוגיות של המוח האפור והעלמות של תאי עצב.

ילדים משבט הקורו החולים בספגת המוח

בהדבקות אלה אין תופעות דלקתיות המאפיינות פגיעה מוחית ע"י נגיפים "קונבנציונלים" - אין עליה בספירת תאי דם או עליה ברכוז חלבון בנוזל השדרה. יתרה מכך, אין תגובה אימונית לגורם ולא נצפו נגיפים בחתכים מחיות במיקרוסקופ אלקטרוני. לעומת זאת יש שינוים במבנה הקרומים הפלסמטיים המרפדים את החללים והצטברות של מבנים חוטיים, (שאורכם הינו 550-100 נ"מ, ומורכבים מ-4-2 סלילים חוטיים בקוטר של 5-3 נ"מ), והצטברות של חלבון עמילואידי כמו במחלות ניווניות לא מדבקות כמו אלצהיימר, פרקינסון ועוד.

האטיולוגיה של המחלות אינה ברורה לחלוטין עד היום. עד שנות השבעים האמינו שגורמי המחלות הינם "נגיפים המורכבים מפיסות קטנות של חומצות גרעין פעילות גנטית, קשורות לחלקי ממברנה פלסמטית."

עד היום לא הצליחו להוכיח מציאות של חומצות גרעין כלשהן בחומר האינפקטיבי, המורכב רובו ככולו מחלבון. לא נמצאו שיירים של חומצות גרעין בפרפרטים נקיים של Scrapie Associated Filaments (SAF), בשיטות של הומולוגית DNA, טרנספקציה, הפעלת נוקלאזות וגם ב-PCR. גורם המחלה הניתן להעברה בהדבקה נקרא בשם "פריון" - Proteinacious lnfectious Organism (prion), מושג שטבע סטנלי פרוסינר מאוניברסיטת קליפורניה בסן פרנציסקו. לפרוסינר הוענק לאחרונה פרס וולף בישראל, לאחר שזכה כבר בפרסים רבים בינייהם פרסי לסקר וארליך. לפרוסינר יש תלמידים ועמיתים הממשיכים במחקרי פריונים במחלקה לנוירולוגיה בהדסה, ירושלים.

רכוז הגורם במוח מגיע ל-108 יחידות מדביקות לגרם ולעתים רחוקות גם באברים פנימיים (כבד, טחול) ובכייל נמוך.

הגורם עובר ממברנות של 220 נ"מ, יציב לחום, לחומרי חיטוי ולקרינה, יבוש והקפאה, וגורם לאחוי תאים. לא נמצא מבחן סרולוגי לגורם, אך בקורו וב-CJD נמצאו נוגדנים עצמיים נגד הנוירופילמנטים שגדלם 10 נ"מ, ביותר מ-60% מהחולים בשלבים מאוחרים של המחלה. הופעת הנוגדנים דומה להופעתם במחלות אוטואימוניות אחרות, בכך שהם מופיעים גם באנשים בריאים ובשכיחות גבוהה יותר בקרובי משפחה של החולים. הם נמצאו גם במחלות אלצהיימר ופרקינסון אך בשכיחות נמוכה יותר, כך שנראה שזו תוצאה ולא גורם. הנוגדנים מכוונים בעיקר נגד חלבון בגודל 200Kda המרכיב את הפילמנטים.

אין טפול או תרופה למחלות אלה.

נשים חולות בספגת המוח בשבט הקורו

מחלת Creuzfeldt-Jacob:
מחלה נדירה, ספורדית בכל העולם בשכיחות של כ-1:106 לשנה, עם שכיחות גבוהה יותר בקרב אוכלוסיות מסוימות ללא קשר משפחתי כמו בסלובקיה, אנגליה, ארצות הברית, יפן, פינלנד, שבדיה, צ'ילי וביהודים יוצאי לוב החיים בישראל (עד פי 30!). בשיתוף הקבוצה הירושלמית בהדסה נקבע שמוטציה מסוימת בקודון 200, המחליפה את החומצה האמינית גלוטמית לליזין, נמצאת אצל קבוצה אתנית זו, ושצורה זו הינה דומיננטית בגרימת המחלה. המוות מגיע תוך שנה, כאשר הגיל הממוצע במוות הינו 57.

ניתן להעביר את המחלה לקופים, וזנים מסוימים גם לחזירי ים, חתולים, אוגרים ועכברים. הסימנים דומים לקורו ברמה תאית, עם יצירת פיברילות עמילואידיות כמו ב-Scrapie.

בחלק מהמקרים המשפחתיים בעלי מעורבות גנטית, המחלה מתפתחת לאט יותר, והדמיון לקורו מתבטא יותר. סינדרום זה נקרא Gerstmann-Straussler-Scheinker, גם כאן ניתן להעביר את המחלה ע"י תרחיף מוח לחיות. מחלה גנטית נוספת מקבוצה זו היא FFI, המתחילה בקשיי שינה ועוברת לשטיון. עד היום נתגלו תשע משפחות הנושאות הפרעה זו.

כושר הדבקה ויציבות של הגורם:
את כל המחלות הנ"ל הצליחו להעביר לחיות מעבדה וחיות משק, ע"י הזרקה תוך מוחית של רקמת מוח נגוע, או ע"י האכלה. מחלת הקורו התפשטה בקרב השבטים בגיניאה החדשה ע"י אכילת מוח של נפטרים מהמחלה, וגם ע"י זהום ריריות ועור פצוע .

למרות ש-CJD הינה מחלה ספורדית המופיעה בשכיחות של כ-1:106 לשנה, תוארו העברות מאדם לאדם במספר מקרים:
  1. לאחר השתלת קרנית מאדם שנפטר מהמחלה (ממוח הנפגע העבירו CJD לשימפנזה לאחר שהחומר שהה בטמפרטורת החדר 7 חודשים ב-90% פורמלין-סליין).
  2. שני מקרים לאחר נתוח מוח והשתלת dura mater שעבר הקרנה מיננת.
  3. שני חולי אפילפסיה שהושתלו באלקטרודות כסף שחוטאו ב-70% אתנול ואידי פורמלדהיד, לאחר ששמשו לטפול בחולי CJD.
  4. שני מנתחי מוח, רופא שיניים ושניים ממטופליו, שנחשפו לרקמה אינפקטיבית בנתוחים ו-PM.
  5. טכנאי פתולוגיה ומספר רופאי שיניים נוספים נפטרו מ-CJD.
  6. שמונה חולים פיתחו מחלה לאחר טפול בהורמון גדילה מיותרת מוח של אדם (לפחות 3 אצוות של ההורמון נמצאו מזוהמות בגורם). מאז הופסק השמוש בהורמון ממקור אנושי ועברו לשמוש בהורמון מהונדס.
לא נצפתה העברה בתרומות דם מחולי CJD שהיו תורמים "מקצועיים".

לגורם יציבות גבוהה לכל הכימיקלים המקובלים, לקרינה ולחום. עקב זמן האינקובציה הארוך (אפילו בשימפנזים יכול להגיע לעשרות שנים), בדיקות סרולוגיות "קשות" לבצוע ולקבלת תוצאות.

חיטוי "יעיל" מתקבל באוטוקלב 15 PSl, 132°C, למשך למעלה משעה, או ב-NaOH 1N - למכשירים ולמשטחים. אפילו חום יבש ב-3600°C - לשעה, משאיר פעילות מסוימת. השיטה היעילה ביותר שפותחה עד היום לנטרול הגורם ברקמות מוח כוללת טיפול בפורמלין (37%) למשך 48 שעות, השרייה בחומצה פורמית (96%) למשך שעה ושוב 48 שעות בפורמלין. בשיטה זו הצליחו להוריד את כייל הגורם בשמונה סדרי גודל (Brown et al. Neurology 40:887, 1990).

ביולוגיה מולקולרית של ה"נגיף":
הפלקים העמילואידים במחלות הנגרמות ע"י פריונים בנויים מחלבון הנקרא Scrapie Amyloid Protein "Prion" - (PrP27-30) שנוצר עקב חתוך פרוטאוליטי ושנוי קונפורמציה של החלבון הנורמלי במאכסן Scrapie Precursor proIeln - (PrP35-37) - רצף cDNA של חלבון המוצא נקבע ורובו אומת ע"י רצף חומצות אמינו של החלבון עצמו.

הגן נמצא על כרומוזום 20 באדם ו-2 בעכבר. (לעומת זאת - הגן לחלבון המצטבר במחלות ה"לא אינפקטיביות" כמו אלצהיימר ופרקינסון וכנראה גם הזדקנות טבעית - נמצא בכרומוזום 21 באדם ו-16 בעכבר. שם החלבון העמילואידי הינו בגודל של K4.1 דלתון ותת-היחידה היא בת 42 חומצות אמינו, ואין כל הומולוגיה ברצף ל-scrapie).

החלבון הינו טרנס ממברנלי, מזדקר משטח התא הנורמלי ותפקידו אינו ידוע, (אולי קשור למשפחת חלבוני תעלות יונים). הרצף הינו נשמר היטב במינים שונים.

המכניזם של שרשרת השנויים קשור להפרעה כלשהיא ב-turnover הגבוה של החלבון המקורי, הנגרמת ע"י הגורם. החלבון עובר לצורה עמילואידית בלתי מסיסה ועמידה לפרוטאוליזה, שגם היא אינפקטיבית. תת יחידות אלה מגרענות פולימריזציה ויצירה עצמית של הצורות החוטיות (SAF) המתגבשות למבנים עמילואידים שנצפים במיקרוסקופ.

פרוסינר מציע שהמעבר מצורה נורמלית לצורה הפתולוגית קשור בשינוי במבנה השלישוני של החלבון. החלבון הנורמלי בנוי מצורות סליליות מקופלות בצורת "אלפא". בצורה האינפקטיבית נפתחים סלילים אלה לצורות "ביתא", וכנראה שהמוטציות הידועות ברצף החלבון מספיקות כדי לשנות את צורת קיפול החלבון. החוקרים ממשיכים ומניחים שהתפתחות המחלה נעשית כאפקט דומינו: מולקולה אחת של החלבון הסקרייפי PrP "נוגעת" במולקולה נורמלית ומשרה בה את הקיפול לצורה האינפקטיבית. מולקולה זו וחברתה שוב "מתקיפות" מולקולות נוספות וכך הלאה, עד שהחלבון הפתולוגי מצטבר לריכוזים הגורמים לתופעת המחלה.

אחת התעלומות בספור הפריונים היא מדוע ואיך ל"זנים" שונים יש זמני דגירה שונים. יתכן שגם בעיה זו ניתנת להסבר ע"י הקונפורמציה של חלבוני הפריון. לנדסברי ובירון מה- NlH במונטנה סיפקו תמיכה לתיאוריה זו. הם לקחו פריונים ממוחות אוגרים מודבקים בשני זנים שונים (איטי ומהיר) וערבבו אותם עם חלבון פריון נורמלי. הם הראו שהחלבון הנורמלי קבל את הקונפורמציה של הפריון אתו בא במגע. כלומר, תכונת הפריון הועברה ע"י החלבון בלבד.

הסתברות השינוי הספונטני של חלבון נורמלי לאינפקטיבי ע"י שינוי קונפורמציה במבנה שניוני ושלישוני של החלבון היא כ-1:106 לשנה, בדומה לשכיחות הכלל עולמית של CJD.

במקרים משפחתיים של CJD ו-GSS הסתברות יצירת חלבון מוטנטי עולה פי 106 כתוצאה מאחת מתוך 4 מוטציות שונות, ששלוש מהן גורמות שנוי בחומצה אמינית אחת בחלבון המוצא. באחת מוחלפת פרולין ללאוצין (בקודון 102) בשניה חומצה גלוטמית לליזין (בקודון 200 כמו במשפחות יוצאי לוב בישראל), ושלישית תוספת בין קודון 39 ל-40. מוטציות אלה לא נמצאו במקרים משפחתיים אחרים וספורדים של CJD או בחולי קורו.

לאכול או לא לאכול?
לאחרונה פורסמו בארץ ובעולם ידיעות, הקושרות לכאורה כ-10 מקרי ספגת מוח באדם באנגליה עם אכילת בשר. מקרים אלה עדיין לא התבררו, אך מאמר שפורסם בעתון Nature (376: 402, 1994) התייחס לתופעה וטוענים שעד היום אין כל הוכחה שאדם חלה במחלה עקב אכילת בשר חיה. באנגליה, בה הרבה עדרי בקר נגועים במחלת "הפרה המשוגעת", הגיעו גם הדווחים המדאיגים על הדבקת אנשים מבקר. דובר על כעשרה מקרים ובהם שני חקלאים שחלו בקרויצפלד-יעקב שהיה להם קשר עם בקר נגוע בשנים 1992 ו-1993, ועל מקרה נוסף של נערה, שחלתה ללא קשר ישיר עם בקר. מקרה של מחלה כזו בנערה הינו נדיר מאד, אך אינו בודד. שני מקרים נוספים תוארו בספרות של צעירים בני 16 ו-19 שחלו במחלה, ללא קשר למחלה בבקר. במקרה של הנערה היתה מגמה לקשור את המחלה לאכילת בשר, ביחוד המבורגרים (אולי בלתי מבושלים מספיק), למרות שהרופאים לא קבעו חד משמעותית שהיא חולת קרויצפלד-יעקב.

באנגליה מופיעים כ-50 מקרי מחלה זו בשנה, ללא קשר למחלה בבקר בהתאם לשכיחות הופעת המחלה בצורה מקרית בעולם.

לאחר פרסום מחלות שני האיכרים באנגליה, חיפשו ומצאו גם מקרה אחד בחקלאי בבלגיה וחמישה חקלאים צרפתיים. בבלגיה לא אותרה מחלת הבקר מעולם, ובצרפת היו מקרים אך ללא קשר גיאוגרפי למחלת החקלאים.

יחידת המעקב והניטור הבריטית הלאומית ל-CJD בבית החולים "הכללי המערבי" באדינבורו, הודיעה עתה כי במהלך השנתיים האחרונות (1995-1994) נתגלו בבריטניה 10 מקרי קרויצפלד יעקב החורגים מהמקובל. החריגה מתמקדת בחמש נקודות:
  1. לא היה בין החולים כל מגע או קשר, גיאוגרפי או משפחתיי לפיכך, ובמיוחד לנוכח הארוע הסימולטני, יתכן שקיים גורם סיכון משותף.
  2. גילם היה נמוך בהרבה מהמקובל לגבי חולי CJD: בממוצע 27.5 שנה (הממוצע למעלה מ-63 שנה). רוב החולים בתסמונת החדשה היו בני 30-25; המבוגר בן 42; הצעירים - בסוף שנות העשרה. שניים עדיין חיים, כנראה.
  3. משך המחלה הממוצע היה 13 חודש (ברגיל - 6 חודשים).
  4. הפעילות החשמלית המוחית (EEG) לא היתה טיפוסית ל-CJD.
  5. אף כי השינויים הפתולוגיים במוח ניתנו לזיהוי כ-CJD, הם חרגו מהמקובל במחלה זו, תוך הופעת ריכוזים גדולים של חלבון הפריון ברבדים חוץ תאיים.
על סמך כל אלה, הודיעה הוועדה המייעצת לספגת מוח (SEAC) כי אין לשלול את האפשרות שמקרים אלה נגרמו בבני אדם מכיוון שנחשפו לספגת מוח הבקר בטרם נאסר השימוש בקמחי בשר בבקר, קרי לפני 1989.

מסתבר שהקשר בין אכילת בשר ממקור נגוע והופעת המחלה באדם אינו ברור, ואם קיים סיכון הרי עיקרו הוא באכילת מוח או אברים פנימיים ולאו דווקא בשר.

חשוב לציין שמחלת "הפרה המשוגעת" לא דווחה בארץ, אך דווח על שני מקרים באזור עכו של מחלה מקבילה ב כבשים (סקרייפי). כמו כן יש לאסור על יבוא בקר ואו קמחי בשר בעלי חיים מבריטניה לישראל.

עדר פרות - ספגת המוח של הבקר הפכה לבעייה כלכלית ובריאותית חריפה ביותר בבריטניה.
מיליוני ראשי בקר מיועדים לחיסול.


האם בני אדם עלולים להידבק בספגת המוח של הבקר?
עקב זמן הדגירה הארוך, עד עשרות שנים, קשה לעקוב אחר מקרים ולוודא התפתחות מחלה. כדי להתגבר על בעיה זו, משתמשים החוקרים בעכברים טרנסגניים, שהוכנס להם הגן לחלבון הפריון האנושי (HuPrP). החלבון הטבעי (PrPc) אינו מזיק ונמצא על פני ממברנות תאי עצב ורקמות אחרות. עקב שינוי גנטי או מגע בחלבון המדביק (PrPsc) מצטבר האחרון ברקמת המוח. ככל שהמרחק הפילוגנטי בין מינים גדול יותר, כן גדול השינוי ברצף חלבוני הפריון שלהם. (רצף חלבון הפרה שונה מזה של כבש ב-7 מקומות, רצף האדם והפרה שונים ב-30 נקודות, ורצף אדם ועכבר שונה ב-28 נקודות.) ככל שהשוני ברצף גדול יותר כן קשה יותר לגרום למחלה ע"י הזרקת הפריון האינפקטיבי לבעלי חיים. כשהרצף דומה, מהירות הופעת המחלה גדולה. מאחר שכך סוברים החוקרים, שעכבר המכיל חלבון פריון אנושי, יהיה חיית מודל רגישה יותר לצורך הערכת אפשרות העברת מחלת הפרה (BSE) לבני אדם.

קולינג' וחבריו הזריקו עכברים נושאי HuPrP ועכברי בקורת רגילים, בתמצית מוח מחולה CJD. העכברים נושאי הגן האנושי שרדו פחות (300-250 יום) מעכברי הביקורת (480 יום ויותר). כשהוזרקו שתי קבוצות עכברים המכילים את שני הגנים הן של עכברים והן של אדם בתמצית מוח פרות חולות ב-BSE, לא נמצאו הבדלים משמעותיים בזמן השרידה (520-450 יום). כלומר מציאות הגן האנושי בעכברים לא קיצרה את זמן האינקובציה של המחלה. קבוצה עכברים נוספת שהוזרקה ב- BSEוהכילה רק גן אנושי עדיין לא חלתה עד פרסום המאמר (268 יום) שהם 63 ימים יותר מזמן השרידה של העכברים בעלי גנום דומה שהוזרקו ב-CJD. למרות שיש בניסויים אלה מודל מעניין ללימוד הפתוגנזה של מחלות פריון, עדיין העכברים הטרנסגניים אינם בני אדם. ולכן יהיו תוצאות ניסוים אלה אשר יהיו, השלכותיהם על שאלת הסיכון בהדבקת אדם ב-BSE אינו ברור.

לקריאה נוספת:
  1. Molecular biology of prion diseases. SB. Prusiner in Science, 252: 1515-1522, 1991
  2. Prion diseases of humans and animals. Ed. SB. Prusiner, J. Collinge, J. Powell and B. Anderton. Ellis Horwood, 1992
  3. Molecular biology of prion diseases. Special issue of Philosophichal transactions of the Royal Society of London, Series B, 343:# 1306; March 29, 1994
  4. Strctural clues to prion replication. FE. Cohen, K-M, Pan, Z. Huang, M. Baldwin, RJ. Flefferick and SB. Prusiner in Science, 264:530-531, 1994.
ד"ר איתן ישראלי וינינה גיטלמן - המכון למחקר ביולוגי בישראל

פורסם ב"סינתזיס" 13, עמ' 14-10, יוני 1996

יום רביעי, 12 ביוני 1996

הדינוקוקוס, האורגניזם היציב ביותר עלי אדמות - פנחס פוקס


מי ישרוד על פני כדור הארץ לאחר שואה גרעינית? מירב החוקרים שנתנו דעתם על שאלה זו מסכימים ביניהם שקרוב לודאי הוא שממלכת החרקים היא זו שתשרוד בצורה זו או אחרת ותאכלס את עולמנו החרב. חוקרים אלה לא נתנו כנראה את דעתם לאורגניזמים היציבים ביותר לקרינה שנתגלו עד היום - חיידקי משפחת ה-Deinococcaceae שלהם כושר עמידות מופלא מפני סוגי קרינה שונים.


חיידקי Deinococcus radiodurans העמידים לקרינה רדיואקטיבית
Prof. Michael Daly, Department of Pathology, Uniformed Services University of the Health Sciences,  Bethesda, Maryland


כיצד נתגלתה משפחת חיידקים זו? תהליך העיקור של קופסאות שימורים, במפעל לשימורי בשר במדינת אורגון בארה"ב, כלל הקרנה בקרני גמא. באחד ממחזורי הייצור בשנת 1956 נמצאו מספר קופסאות שהתקלקלו. מיקרוביולוג בשם Anderson בודד מקופסאות אלה חיידק קרקע גראם חיובי, שאינו יוצר נבגים, הנותן מושבות ורודות בגידול על אגר. לחיידק זה היה כושר עמידות בלתי רגיל לאפקטים הקטלניים והמוטגניים של קרינת מיננת וקרינת UV. בשנת 1961, לאחר שנלמדו תכונותיו המיוחדות של חיידק זה כינה Anderson אותו בשם Radiodurans (זן R1) ובשנת 1995 זכה החיידק למקום של כבוד בספר השיאים של גינס (Guinness Book of Records) כ"חיידק הקשוח ביותר עלי אדמות".

במהלך השנים שעברו מהבידוד הראשוני היו בידודים נוספים של החיידק בארה"ב וביפן ויותר מאוחר הוסב שמו ל-Deinococcus. (Deinos פירושו ביוונית מוזר, בלתי רגיל). ב-1980 בודד זן נוסף של החיידק כגורם זיהום של בית חולים באונטריו, קנדה. ל-DNA של זן זה שכונה Deinococcus radiodurans SARK הייתה הומולוגיה של 33% לזן R1. גם לחיידק זה הייתה עמידות מופלאה לקרינה מייננת, לקרינת UV ולחומרים מוטגניים. תכונות אלה, כמו גם המבנה המיוחד של דופן התא ורצף הבסיסים של ה-16S ribosomal RNA, המשותפות גם למינים האחרים של משפחה זו שבודדו במשך השנים, D. radiophilus, D. proteolyticus ו-D. radiopugnas. מין נוסף במשפחה זו, Deinobacter grandis, אינו נקד (Coccus) כשאר חברי המשפחה, אלא מתג, אולם גם בגנוטיפ וגם בפנוטיפ אין הוא נבדל משאר חברי המשפחה. אם נסכם מבחינת קלסיפיקציה, בגנוס Deinococcus ישנם ארבעה חברים, חבר אחד בגנוס Deinobacter ויחד הם מהווים את אחת מעשר משפחות החיידקים הידועות, והקטנה שבהן. מבחינה אבולוציונית זוהי משפחה יחודית המרוחקת מ-Escherichia coli באותה מידה כמו מ-Bacillus subtilis.

תכונותיו המיוחדות של החיידק ומבנהו המיוחד, עליו נתעכב מעט בהמשך, הביאו למספר השערות לגבי מקורו האבולוציוני, חלקן נראה כאילו לקוח מספרות המדע הבדיוני. Berkner ו-Marshal הציעו בשנת 1964 שתכונותיו המיוחדות של הדינוקוקוס נבעו מלחצי סלקציה לעמידות לרמה מוגברת של רדיקלים חופשיים ולתנאי קרינה קיצוניים ששררו באווירת כדור הארץ בפרה-היסטוריה. חוקרים אחרים ובינם Hoyle ו-Wickramasinghe טענו בשנת 1981 שהדינוקוקוס ניצל את תכונותיו המיוחדות לשרוד בתנאי הריק וקרינת ה-UV הקיצונית השוררים בחלל החיצון. לאחרונה טענו Minton ו-Daly (1995) שרמות קרינה כה גבוהות שלהן עמיד הדינוקוקוס לא שררו מעולם בעולמנו, גם לא בתחילת הווצרותו. הדינוקוקוס לדעתם פיתח עמידות לתנאי יובש קיצוניים, תנאים שאף הם יוצרים פרגמנטציה של ה-DNA. העמידות לקרינה היא לכן תוצאה מקרית מהעמידות לתנאי יובש. במה מתבטאת עמידותו המיוחדת של הדינוקוקוס לקרינה? חשיפה של בני אדם למנת קרינה מיננת של 600-500 ראד (או 5-6 Gy ביחידות S.I.) תסתיים במותם הכמעט ודאי. מנת הקרינה הנדרשת לעיקורו של הדינוקוקוס היא 50,000-60,000 Gy ולחיידק עמידות גבוהה למנות קרינה של 5000-30000 Gy כשה-D37 הוא כ-17500 Gy. איור מס' 1 מדגים את כשר עמידותו הגבוה של הדינוקוקוס זן הבר - R1, לקרינה מיננת, קרינת UV, ולתרכובת האלקילתית (alkylating agent) מיטומיצין C (MMC - mitomycin C) באיור מודגמת גם התנהגותם של מספר מוטנטים של החיידק עליהם נתעכב בהמשך. בהשוואה, בקנה המידה של האיור ייפול גרף האינקטיבציה של E. coli על ציר ה-Y.

איור 1: חיוניות הדינוקוקוס לאחר השראת נזקי DNA
מדידות חיוניות החיידקים לאחר השראת נזקי DNA נעשתה בתרביות שגדלו במשך הלילה.
התרביות נמהלו לריכוז הדרוש והוקרנו בקרינה מיננת ע"י Co60 כשהחיידקים נשמרים בטמפ' של 4°C,
מנורת UV באורך גל של 254nm ובמנת קרינה של 1.0 J/m2/sec כשהתאים מפוזרים בשכבה דקיקה על פני צלחת פטרי
לגבי קרינת UV והדגרה בטמפ' של 23°C עבור הטיפול ב-MMC. R1 הוא גזע הבר של דינוקוקוס; 6R1A הוא המוטנט pol-
שהתקבל בשיטות של הנדסה גנטית; 303 הוא המוטנט pol- שהתקבל ע"י מוטגנזה כימית.
6R1A + DNApol, 6R1A + Klenow ו-303 + Klenow הם המוטנטים שעברו טרנספורמציה ע"י מקטע DNA המקודד
ל-DNA polymerase I של E. coli או לפרגמנט Klenow של אנזים זה.


מבנה החיידק
כאמור במבוא, רב חברי משפחת ה-Deinococcaceae הם נקדים גראם חיוביים הנותנים מושבות בגוון ורוד. למרות היותם גרם חיוביים יש לחיידקי המשפחה מבנה דופן מיוחד במינו שלא תואר לגבי אף אחת ממשפחות החיידקים הגראם חיוביים האחרות (איור 2). לדופן זו ארבע שכבות מחוץ לממברנת התא ולכל אחת מהן מבנה בלתי רגיל. הממברנה החיצונית והפנימית מופרדות ע"י שתי שכבות. הראשונה שכבת פוליגליקן מחוררת המכילה אלנין, חומצה גלוטמית, גליצין ו-L-אורניתין (במקום הליזין או החומצה הפימלית הנפוצות יותר). החרירים שבשכבה זו הם בקוטר 10 nm. מבנה השכבה השניה הקרויה שכבת המחיצות (Compartmentalized layer) אינו ידוע. הממברנה החיצונית מכילה ליפידים דומים לאלה שבממברנה הפנימית אך ביחסים שונים. השכבה השלישית קרויה HPI (Hexagonal Packed lntermediate) ומכילה חלבון המאורגן בתת-יחידות משושות. השכבה הרביעית שמעליו היא שכבה עבה של סוכרים דחוסים. את הדופן הייחודית הזאת ניתן לחלק לשני חלקים (איור 2): השכבה המחוררת והמעטפת. המעטפת הדומה בכמה ממאפיניה למעטפות האצות הכחוליות, עוטפת בדרך כלל שני תאים ונוצרת על גבי תאי הבת לאחר החלוקה.

גם הליפידים של משפחת הדינוקוקוס מיוחדים ושונים מהמוכר במשפחות חיידקים אחרות. תרומתה של הדופן לעמידות הגבוהה של החיידק אינה ברורה וכך המצב גם לגבי מספר מולקולות תוך-תאיות הנמצאות בריכוז גבוה. אחת מהמולקולות האלה היא הקרוטנואיד - הפיגמנט האדום של החיידק שתחילה יוחסה לו חשיבות בהגנה בפני קרינה, אולם מוטנטים חסרי צבע שנתגלו היו יציבים לקרינה כמו גזע הבר.

לחיידק תכולת סולפידרילים גבוהה ובודד גם "פקטור" סולפידרילי שהקנה כביכול הגנה בפני קרינה גם ל-E coli. לחיידק גם ריכוז גבוה במיוחד של מנגן וגם לו יוחסה חשיבות בהגנה בפני קרינה בגלל יכולתו להפחית את רמת תוצרי ההקרנה ב-UV, במיוחד דימרים של תימין. מנגן מעלה גם את רמת הסופראוקסיד דיסמוטז (SOD) בתאי הדינוקוקוס. אנזים זה תוקף רדיקלים חופשיים ועי"כ, הניחו החוקרים, מקטין את הנזק ל-DNA. אולם כנגד השערות אלה קיימת העובדה הפשוטה שלאחר מנת קרינת UV של 500 J/m2, 1% מהתימין בתא מופיע כדימרים הן בדינוקוקוס והן בחיידקים אחרים. אך בעוד לחיידקים האחרים מנה זו היא מנה ממיתה, הדינוקוקוס עמיד בפניה. קשה לכן לדעת האם לכל המולוקולות הנ"ל תפקיד בעל משמעות בהגנה בפני נזקי DNA.

איור 2: מבנה המעטפת של הדינוקוקוס: לדינוקוקוס מבנה מעטפת ייחודי בעולם החיידקים. מעטפת זו מקנה לו קשיחות ודורשת אמצעים מיוחדים על מנת למצות את מוהל התאים.


נזקי הקרינה והתרכובות האלקילתיות
כבר מתחילת המחקר בדינוקוקוס היה ברור לחוקרים שעמידותו של הדינוקוקוס לנזקי קרינה ולצורות אחרות של נזקים ל-DNA נובעת ממנגנוני תיקון נזקי DNA יעילים ביותר. מדידות של מספר הפגיעות ב-DNA של החיידקים המוקרנים או המטופלים הראו רמת נזק גבוהה ביותר, כזו המצופה ממנות הקרינה העצומות או מהחשיפה המסיבית לכימיקלים השונים. רמות נזק אלה מסוגל הדינוקוקוס לתקן כשמנגנון תיקון יעיל זה עדיין לא מובן די צרכו.

מה הנזק הנגרם ע"י חומרים אלקילתיים, קרינת UV וקרינה מיננת? נתעכב על כך בקצרה. החומרים האלקילתיים הם תרכובות בעלות אפיניות נוקלאופילית הנקשרות בעיקר לחנקן N7 של גואנין או N3 של אדנין המהווים אתר נוקלאופילי. בהיותו גורם מונו-וביפונקציונלי יכול ה-MMC להקשר לכל אתרי החנקן והחמצן המתאימים ועי"כ נגרם נזק למבנה הסלילי ונוצרים קשרים רבים בין גדילי ה-DNA וההכפלה והשיעתוק מעוכבים לחלוטין. קרינת UV, בתדירות גבוהה (200-290 nm) נבלעת בקלות ע"י DNA ו-RNA וגורמת נזק לשניהם ע"י יצירת דימרים של בסיסים ויצירת תוצרי קרינה אחרים. דימרים אלה גורמים לעיבוי ולהפרעות במבנה הסלילים וכתוצאה לעיכוב הכפלת ה-DNA. הדימרים אינם מוגבלים לתימין בלבד אלא יכולים לחול גם בין מולקולות ציטוזין. תוצרי קרינה נוספים הם הדימרים פירימידין-פירימידין (6-4) המהווים כ-17% מכלל הנזק ל-DNA ומשתווים לאחוז הדימרים של תימין, והתימין-גליקול הנוצר בעיקר כתוצאה מקרינה מיננת אך יכול אף להווצר לאחר קרינת UV.

הקרינה המיננת מאופיינת ע"י יכולתה להשרות יצירת יונים חיוביים ושליליים. פעילותה של הקרינה המיננת היא לכן ישירה על מולקולות המטרה דוגמת שחרור אלקטרונים מאטומים ב-DNA. לקרינה זו גם פעילות בלתי ישירה ע"י יצירת רדיקלים דוגמת רדיקלים הידרוקסיליים המגיבים עם ה-DNA. ספיגה ישירה ויחידה של אנרגיה ב-DNA יכולה להביא לצבר של פגיעות כתוצאה מיצירת רדיקלים בסביבה הקרובה למקום הפגיעה. את רובו של האפקט הממית של הקרינה המיננת ניתן ליחס לשברים הנוצרים ב-DNA ובעיקר לשברים הדו-גדיליים (DSB - souble strand breaks). סוג זה של נזק דורש מנגנוני תיקון מיוחדים ובעוד E. coli (וכמוהו רב האורגניזמים האחרים) מסוגלים לתקן בין שניים לשלושה DSB לכרומוזום יכול הדינוקוקוס לתקן למעלה מ-130! DSB מתוך מאות הפרגמנטים של ה-DNA הנוצרים לאחר קרינה בסדרי גודל של 10,000 Gy ויותר, מסוגל הדינוקוקוס תוך 24-12 שעות לבנות את הכרומוזום מחדש ביעילות מופלאה ללא תמותה או מוטגנזה.



מנגנוני תיקון נזקי DNA של הדינוקוקוס
כיצד יתכן מנגנון תיקון יעיל שכזה?
ל-E. coli יש שלושה מנגנונים לתיקון נזקים ב-DNA. האחד, תיקון ע"י חיתוך והסרה של בסיסים פגועים - Excision repair, השני תיקון ע"י רקומבינציה, והשלישי הקרוי SOS error prone repair מסלק דימרים של תימין הנוצרים במזלג השיכפול בשלבי הגידול הלוגריתמי של החיידק. בדינוקוקוס קיימים שני המנגנונים הראשונים בלבד.



תיקון ע"י חיתוך והסרה (Excision repair)
לדינוקוקוס שני מסלולים בלתי תלויים של תיקון ע"י חיתוך והסרה. הראשון קיבל את השם UV Endonuclease α הוא תוצר הגן mtcA ההומולוגי ל-UvrA של E. coli. מקובל היום לחשוב שחלבון זה - UvrA משתתף במסלול תיקון אנלוגי למערכת האנזימים UvrABC של E. coli. מערכת זו השייכת לאנזימי ה-SOS עוברת אינדוקציה כתוצאה מקרינת UV (כנראה ע"י ה-ssDNA) ומסירה את הבסיסים הפגומים שנוצרו לקראת תיקונם. בדומה, ה-UV Endonuclease α של הדינוקוקוס חיוני לחיתוך ה-DNA לאחר חשיפה ל-MMC.

תאים שבהם מוטציה יחידה באתר זה הופכים רגישים ל-MMC. בניגוד למצב ב-E. coli למוטנטים אלה יציבות לקרינת UV כמו לגזע הבר והם מסוגלים לסלק דימרים של תימין בעזרת אנזים שני, ה-UV Endonuclease β - שהוא תוצר הגן uvsCDE. רק מוטנטים של דינוקוקוס החסרים את שני האנזימים α ו-β יהפכו רגישים ל-UV. האנזים α בודד ונמצא שהוא חלבון מונומרי בגדל 36 kDa המבצע בנוכחות יוני Mn2+ חיתוך אנדונוקלאוליטי סמוך לדימרים של פירימידינים. בשנים האחרונות נמצאו בדינוקוקוס אנזימים נוספים המשתתפים בתיקון נזקי DNA, ביניהם: Thymine - glycol glycosidase, Apurinic/apyrimidinic endonuclease, Uracil DNA Glycosidase ושני אנזימים עליהם נרחיב את הדיבור בהמשך - DNA Polymerase I ו-RecA.

איור 3: בדיקת פעילות DNA פולימרז על גלים של אקריל-אמיד.
מיצויי מוהל תאים של החיידקים שנבדקו הורצו על גלים של אקריל-אמיד-SDS שהכילו בתוכם DNA שעבר פרגמנטציה.
פעילות האנזים נבדקה, לאחר שה-SDS נשטף מהגלים, ע"י שימוש בדאוקסיציטוזין מסומן בזרחן רדיואקטיבי.
A. השוואת הפעילות האנזימטית של זני דינוקוקוס לגזע הבר ול-E. coli: 1 : E. coli pol+ 2: 6R1A
3: E. Coli pol- 5-4: 1R 6: 6R1A. המשקל המולקולרי (מ.מ) של אנזים ה E. coli הוא (ע"פ רצף הבסיסים שלו)
103 kDa. בגלים התקבל פס פעילות עיקרי במ.מ של ~105 kDa ב-E. coli עם פסי פעילות נוספים במ.מ. של 74 ו-85 kDa.
לגזע הבר של הדינוקוקוס (R1) היו פסי פעילות אנזימטית בטווח מ.מ. של 69-92kDA וכפי שנראה בלוח B
הסיבה לכך היא פעילות חזקה של פרוטאזות שנמצאות במיצויים של הדינוקוקוס ומבקעות את הפולימרז
(הן של הדינוקוקוס והן של E. coli (לוח B מסלולים 4-3)) ביעילות רבה ובמהירות.
B. הפעילות האנזימטית של מוטנט חסר DNA פולימרז לאחר טרנספורמציה שלו עם DNA המקודד לפולימרז של E. coli.
1,2: E. coli pol+ 3,4: מיצוי R1 + מיצוי E. coli pol+ 5: E. coli pol+ 6: 303 7: 303 + Klenow


Moseley ו-Copeland הראו שהרגישות של מוטנטים ב-mtcA ל-MMC אינה עולה באם הם פגועים באתר נוסף אותו כינו uvsA. כיום ברור מסדרה ארוכה של מחקרים מקבוצתו של Minton שאותו אתר הוא למעשה אתר ה-pol (המקודד לאנזים DNA polymerase). מכיוון שנוכחות מוטציה ב-pol אינה מעלה, כאמור לעיל, את רגישות החיידקים ל-MMC מעבר למה שמקנה המוטציה ב-mtcA (במוטנט הכפול mtcA pol) יש להניח שה-DNA פולימרז פועל באותו מסלול של ה-UV Endonuclease α. בדומה, היות והמוטנט הכפול הנ"ל רגיש גם לקרינת UV (למרות שהאנזים UV Endonuclease β אינו פגוע) יש להניח שהגורם לרגישות הוא החסר באנזים DNA פולימרז החיוני גם במסלול האנזים β, אחרת למוטנט הכפול הנ"ל הייתה יציבות לקרינת UV כמו לגזע הבר או כמו למוטנט היחיד mtcA.

הזן אותו כינו Moseley ו-Copeland eIvsA הוא הזן 303 (ראה איור 1) שהתקבל ע"י מוטגנזה של גזע הבר (R1) עם ניטרוזוגואנידין. הדינוקוקוס הוא חיידק העובר טרנספורמציה באופן טבעי, כלומר הוא מסוגל לקלוט DNA ממצע הגידול, ואם ההומולוגיה מספיקה - לעשות לו רקומבינציה עם הכרומוזום הבקטריאלי. Minton וחבריו ניצלו תכונה זו ובנו ספריה של קוסמידים המכילה DNA גנומי של גזע הבר. בעזרת ספריה זו נעשתה טרנספורמציה של המוטנט 303 ובודד ה-DNA שהחזיר למוטנט את הפנוטיפ היציב לקרינה ול-MMC של גזע הבר. DNA זה היה ORF בגודל של 2763 בסיסים (921 ח' אמינו) בעל הומולוגיה של 51% ל-DNA המקודד לאנזים DNA polymerase I של E. coli (שלו אורך של 2784 בסיסים ו-928 ח' אמינו). ההומולוגיה והזהות בח' האמינו היו של 53% ו-41% בהתאמה.

זן 303 וזנים מוטנטיים דומים התקבלו ע"י מוטגנזה כימית ואין להוציא מכלל אפשרות שהם פגועים גם בגנים אחרים. כדי להוכיח שפגיעה בגן המקודד ל-DNA פולימרז יכולה לכשעצמה להביא לשינוי הדרסטי של הפנוטיפ, מיציבות קיצונית לנזקי DNA לרגישות הדומה לזו של חיידקים אחרים, החליטו Minton וחבריו להשרות מוטציה מכוונת באתר הפולימרז בשיטות של הנדסה גנטית. זאת עשו ע"י החדרה מכוונת (ע"י טרנספורמציה ורקומבינציה) של מקטע DNA בגדל של 3.1 kb המקנה יציבות לכלורמפניקול לתוך הגן של הפולימרז. הזן שהתקבל, 6R1A, היה איזוגני עם גזע הבר אך פגוע ספציפית באתר pol. מוטנט זה היה רגיש לקרינה מיננת, קרינת UV ו-MMC אף יותר מהזן 303 (איור 1).

בדיקת הפעילות האנזימטית של מיצוי חיידקים על "גל פעילות של אקריל אמיד" (activity gel) הראתה שבדומה לזן 303 (איור 3B) גם זן 6R1 חסר לחלוטין פעילות של DNA פולימרז I (איור 3A). ברור לכן שהאנזים חיוני להקניית היציבות הגבוהה לנזקי DNA. אולם השאלה הנשאלת היא האם הוא מהווה את המפתח ליציבות, כלומר האם לאנזים של הדינוקוקוס תכונות המייחדות אותו מאנזימים דומים בחיידקים אחרים?

כדי לענות על שאלה זו ביטאו Minton וחבריו את הגן DNA polymerase I של E. coli ומקטע ה-DNA המקודד לפרגמנט Klenow של האנזים במוטנטים של הדינוקוקוס. זאת עשו ע"י ניצול תכונה נוספת של הדינוקוקוס - יכולתו לעשות Duplication insertion לגן זר. ע"י שימוש בוקטור אינטגרציה מתאים ניתן להכניס לכרומוזום החיידק גן ללא פרומוטור. הוקטור מכיל מקטע ליציבות לאנטיביוטיקה המבוטאת באופן חלש ביותר. בהשפעת לחץ סלקטיבי של אותה האנטיביוטיקה עובר הוקטור בכרומוזום אמפליפיקציה ומאפשר עי"כ לגן המצורף (ובמקרה זה הפולימרז של E. coli או פרגמנט Klenow שלו) להתבטא במספר רב של עותקים (עד ל-50 לכרומוזום). טרנספורמציה זו עם האנזים של E. coli החזירה למוטנטים את הפעילות האנזימטית (איור 3B) ויחד איתה את הפנוטיפ של זן הבר - היציבות הייחודית לנזקי DNA (איור 1). המסקנה כמובן היא שאין לדינוקוקוס פולימרז בעל יחוד. האנזים (בין אם הוא אנזים עצמי של הדינוקוקוס או אנזים מחיידק אחר) דרוש לחיידק לצורך מנגנוני התיקון היעילים אולם לכשעצמו אין הוא מספיק להקניית העמידות.

תיקון ע"י רקומבינציה
בין שאר המוטנטים שהשרו Moseley ו-Copeland היה זן שכונה rec30 שהיה רגיש ביותר לכל סוגי נזקי DNA. החיידק לקה בכושרו לעבור טרנספורמציה וגידולו היה איטי. קבוצת המחקר של Minton פיתחה שיטה לטרנספורמציה טבעית של זן זה. למרות שיעילות טרנספורמציה זו הייתה בשני סדרי גודל קטנה יותר מגזע הבר הצליחו החוקרים, בשימוש במתודולוגיה שהופעלה לגבי ה-DNA פולימרז, לשבט את האתר הפגום שבמוטנט. נמצא שאתר זה הומולוגי ל-recA של חיידקים אחרים (56% זהות בח' האמינו עם האנזים של E. coli). גם כאן הכינו החוקרים מוטנט בעל מוטציה מכוונת באתר ולמוטציה זו שכונתה 1R1A היה פנוטיפ זהה למוטנט rec30 - דהיינו רגישות לנזקי DNA. החוקרים הקדישו מאמצים רבים בניסיונות לשבט את האנזים ב-E. coli ועי"כ לנסות ולשנות את עמידות ה-E. coli לקרינה אולם ללא הצלחה. התאים, במידה והטרנספורמציה הייתה מוצלחת, עברו ליזיס. הסיבה, לדעתם של החוקרים, יכולה להיות מכיוון שב-E. coli חלק גדול מה-RecA קשור לממברנה והכנסת האנזים הדינוקוקלי יכולה לגרום לשיבושים בקשר זה ולנזק בממברנה, או שהאנזים של הדינוקוקוס גורם לאינטרקציה של DNA-DNA באתרי הקישור של ה-DNA לממברנה ועי"כ גורם לנזק ממברנלי ולליזיס.

בדומה למה שנעשה לגבי ה-DNA פולימרז ניסו Minton וחברי קבוצת המחקר שלו להחדיר recA של חיידק זר לדינוקוקוס. הפעם השתמשו מסיבות טכניות בגן של Shigella flexneri שהאנזים לו הוא מקודד זהה לזה של E. coli. למרות ביטוי חזק של הגן בדינוקוקוס (שהוכח ע"י Western blot) לא היה כל שינוי בפנוטיפ של המוטנטים rec30 ו-1R1A הם נשארו רגישים לקרינה, בעלי יכולת טרנספורמציה טבעית נמוכה וגידול איטי. כלומר, למרות שקומפלימנטציה טבעית של recA בין זני חיידקים שונים היא תופעה רווחת הרי שהדינוקוקוס הוא היוצא מן הכלל ודורש, אולי, אנזים בעל תכונות מיוחדות.

recA בדינוקוקוס מתבטא רק לאחר החשיפה לקרינה - mRNA של החלבון לא ניתן לזיהוי לפני החשיפה, מיד לאחריה ו-24 ו-48 שעות אחריה. רק בין 9-1.5 שעות לאחר הקרנת החיידק ב-Gy 17,000 (D37) ניתן היה לזהות mRNA לחלבון. יתכן והסיבה היא ש-Rec30 בתאי דינוקוקוס שלא ניזוקו מעכב גידול בגלל האינטרקציה שלו עם ה-DNA ולכן נמנע ביטוי החלבון בתאים לא פגועים.

מהי פעולתו של אנזים זה? בתאים פרוקריוטים מחפש האנזים אזורים הומולוגיים בין שתי מולקולות של DNA דו-גדילי, מביא לחילופי מקטעי גדילים ומעורב בתיקון DSB. כאמור לעיל ב-E. coli כמו ברוב האורגניזמים, מסוגל האנזים לתקן 2-3 DSB מבלי שתגרם תמותה. E. coli חייב להיות recA+ ויש הכרח בנוכחות כרומוזום בקטריאלי נוסף (ל-E. coli 4-5 כרומוזומים בקטריאליים הפלואידים בשלב הגידול הלוגריתמי שלו). יכולת זו רחוקה מכושרו המופלא של הדינוקוקוס לתקן למעלה מ-130 DSB מבלי שתגרם תמותה.

בתאים איקריוטיים שהם באופן טיפוסי דיפלואידיים או טטרפלואידיים הרקומבינציה בין הכרומוזומים היא תכונה נורמלית החלה במיוזה. בשמרים מקובל כיום לחשוב ש-DSB המושרים ע"י השמר עצמו, שמספרם כ-100, הם הפריקורזורים לרקומבינציה שבמיוזה. לחלבון RAD51 בשמרים, שהוא החלבון המקביל ל-recA, פעילות in vitro דומה לאחרון והומולוגיה בחומצות האמיניות.

תהליך הרקומבינציה שבתאים האיקריוטיים יכול לתרום אולי להבנת התהליך החל בדינוקוקוס. בחלוקה המיוטית הראשונה של התאים האיקריוטיים, בשלב הפרופזה, הכרומוזומים ההומולוגיים נצמדים יחדיו ליצירת דופלקס במכניזם שעדיין אינו מובן כל צורכו. ישנה השראה של DSB וחילופי מקטעים מתאימים בין הגדילים. כאמור השמרים מסוגלים לתקן כ-100 DSB כחלק מתהליך החלוקה שלהם, בתנאי שהכרומוזומים מזווגים אחד למשנהו כך שה"סובסטרט" לרקומבינציה זמין מידית ובמקום הדרוש. יתכן ומנגנון דומה קיים בדינוקוקוס. הכרומוזומים הבקטריאליים ההפלואידים של הדינוקוקוס עשויים להיות מוצמדים בהתאמה מלאה אחד למשנהו דבר הנותן יתרון משמעותי בתיקון DSB. הרמה הגבוהה של רקומבינציה בין-כרומוזומלית יכולה לנבוע מהמספר הגבוה של הכרומוזומים בדינוקוקוס. בשלב הגידול הסטציונרי יכול מספרם להיות בין 4 ל-5 והוא עולה לעד 10-8 בשלב הגידול הלוגריתמי. מספר גבוה של כרומוזומים אינו נדיר בין החיידקים ואינו בהכרח קשור ליציבות לנזקי DNA. לדוגמה ל-Micrococcus sodonensis מספר גבוה של כרומוזומים והם רגישים לקרינה. ל-Azotobacter vinelandii קרוב ל-80 כרומוזומים ונמצא שהוא רגיש לקרינת UV. לכן יש להניח שיש גורמים נוספים מלבד מספר רב של כרומוזומים המשתתפים בתיקון נזקי DNA. Minton וחבריו סוברים ששלב חשוב בתיקון הנזק הוא שלב ההצמדה המותאמת של הכרומוזומים. הם מעלים את ההשערה שהצמדה זו נעשית ע"י צמתי Holliday (Holliday Junctions). קשרים אלה הקרויים גם Four strand junctions הם קשרי ביניים בתהליך הרקומבינציה בין אזורים זהים או הומולוגיים של שני דופלקסים של DNA. הקשרים עצמם הם בעלי אופי חד-גדילי ומסוגלים לנוע חופשית באזור הזהות או בצורה ספונטנית או באופן אנזימטי. אם אכן קיים בדינוקוקוס סידור כרומוזומלי כזה ניתן יהיה להסביר את יעילות הרקומבינציה ביתר קלות. ל-Minton וחבריו ממצאים פרלימינריים התומכים בהשערתם כמו צביעה ב-DAPI המגלה צורות טבעתיות שלא הובחנו באורגניזמים אחרים.

סיכום
כ-40 שנה חלפו מאז בודד הדינוקוקוס לראשונה ונלמדו תכונותיו. למרות המאמץ המחקרי הרב שהושקע בברור המנגנונים האחראיים לעמידותו הייחודית בפני נזקי DNA שונים לא נמצאה עדיין התשובה הברורה לכושרו המדהים של החיידק לתקן נזקים אלה. האם תורמים לכך מבנה הדופן המיוחד שלו, תכולת המולקולות התוך-תאיות המיוחדת או אנזימי תיקון יחודיים? קשה בינתיים לתת תשובה ברורה. יתכן וכל הגורמים האלה חוברים יחד וכתוצאה מתקבל מנגנון התיקון היעיל ביותר בטבע. אם תוכח נוכחותם של צמתי Holliday (כפי שמציעים Minton וחבריו) ברור שלהצמדת הכרומוזומים הרבים של החיידק ליחידה מותאמת אחת השפעה מכרעת בתהליכי תיקון שונים ובעיקר בתהליך הרקומבינציה. בתהליך תיקון זה משתתף כנראה אנזים ייחודי לדינוקוקוס (שלא כדוגמת ה-DNA פולימרז הפועל באותה מידה של הצלחה גם אם מקורו מחיידקים אחרים).

האם לדינוקוקוס מאפינים נוספים היחודיים רק לו, גם על כך קשה עדיין לענות, רק אפס קצהו של גנום החיידק זוהה. קביעת רצף ה-DNA של כל החיידק רק היא שתוביל להבנה משמעותית יותר של הביולוגיה שלו. ואכן, לאחרונה פנה משרד האנרגיה האמריקאי לחברת TlGR (The Institute for Genomic Research) והציע לה חוזה שבמסגרתו יקבע רצף הבסיסים המלא ב-DNA של הדינוקוקוס.

הערה:
עם הבאת הדברים לדפוס הופיעה סקירה קצרה ב-ASM News מחדש אפריל 1996 המציינת עבודה חדשה של Battista ו-Mattinore המתיחסת לעמידות הדינוקוקוס לתנאי יובש ופורסמה ב-J. Bacteriol. 178 (1996), 633.



לקריאה נוספת
  1. Moseley, B.E.B. (1983) Photochem. Photobiol. Rev. 7, 223.
  2. Gutman P. and Minton K.W.(1994). Mutation Res. DNA Repair 314, 87.
  3. Minton K.W (1994). Molec. Microbiol. 13(1), 9.
  4. Minton K.W (1995). BioEssays 17(5), 457.
ד"ר פנחס פוקס, המחלקה למחלות זיהומיות, המכון למחקר ביולוגי בישראל

פורסם ב"סינתזיס" 13 (יוני 1996) .

יום שלישי, 11 ביוני 1996

קיפול חלבונים שגוי ומחלות - איתן ישראלי

 

בשנת 1972 זכה כריסטיאן אנפינסן בפרס נובל לכימיה על עבודותיו משנת 1960, בהן קבע שהמבנה התלת-ממדי הסופי של החלבון נקבע אך ורק ע"י רצף החומצות האמיניות (ח"א) שלו. גישה זו מקובלת מאז שנות השישים, ולמעשה טוענת שרצף מסוים של ח"א יכול להוביל למבנה השלישוני של החלבון. אך מסוף שנות השבעים, למדו חוקרי הביוטכנולוגיה שאין הדבר פשוט כל כך. כשניסו לייצר חלבונים בשיטות של הנדסה גנטית, כמו אינסולין והורמון הגדילה, בחיידקים, נוכחו שלקבל חלבון מקופל בצורה הנכונה היא משימה לא קלה. לעתים קרובות במקום להתקפל בצורה הנורמלית, התקבצו החלבונים לצברים בלתי מסיסים חסרי צורה יחודית וכמובן בלתי פעילים.


תופעה זו של יצירת צברים הובחנה גם בניסויים במבחנה. בשנות השבעים מצא גולדברג ממכון פסטר שלאחר דנטורציה של החלבון כימוטריפסינוגן, ובתנאי קיפול מחדש, החלו המולקולות להתקפל כשורה, אך כשצורות מקופלות חלקית היו במגע עם חברותיהן, הן נדבקו זו לזו ושקעו בצורת צברים. החוקרים מצאו שניתן לשפר את תהליך הקיפול הנכון ע"י הורדת ריכוז החלבון בתמיסה. בהמשך המחקרים קבעו גולדברג וחבריו שצורת חלבון מקופלות חלקית נדבקות לבנות מינן בלבד ולא לחלבונים אחרים. בניסויים שנעשו בשנות השמונים נמצא שאפילו שינוי מזערי ברצף החומצות האמיניות עשוי למנוע הצטברות או לזרז אותה. קינג, מהמכון הטכנולוגי של מסצ'וסטס, מצא ב-1981 מוטציות קובעות קיפול הרגישות לטמפרטורה. קינג עבד עם מעטפה של נגיף, בו שונתה רק חומצה אמיניות אחת בלבד. בטמפרטורה נמוכה התקפל החלבון כהלכה, אך בטמפרטורה גבוהה, הגורמת לקיפול חלבון להיפתח - הצטברו המולקולות לצברים. באמצע שנות השמונים הראו ברמס וחבריו מחברת אפג'ון, שבניסויים במבחנה הצליחו למנוע הצטברות של הורמון הגדילה של בקר ע"י החלפת חומצה אמינית אחת, זאת מבלי לפגוע בקיפול הנכון וכמובן בפעילות.

בשנים האחרונות נמצא שבתאים נמצאים חלבונים "מלווים" (chaperonins) שתפקידם להקשר לשרשראות חלבון שנוצרו זה מקרוב ועוזרים להן לעבור את תהליך הקיפול. הם מונעים מתוצר הביניים להגיע לנקודה שאין ממנה חזרה. חלבונים מלווים אלו חסרים בחידקים ומשום כך חלבוני הביניים נוטים להצטבר בחיידקים.

להתנהגות זו של החלבונים במבחנה או בשיטות היצור הביוטכנולוגיות, נמצאה מקבילה בבעלי חיים. בסדרת המחלות הנקראות "עמילואידוזיס", שוקעים חלבונים שונים בצורות חוטים ובצברים באברים שונים. המפורסמת ביותר בין המחלות הללו היא מחלת אלצהיימר. הצברים הללו הינם בלתי מסיסים ומשום כך קשה ללמוד אותם. החוקרים ידעו שמוטציות עלולות לגרום לשקיעת חלבונים אך לא על הדרך בה נוצרים הצברים.

ג'פרי קלי מאוניברסיטת טקסס, בחר ללמוד את אחד חלבוני העמילואידוזיס שנקרא טרנסתורטין. חלבון זה הנמצא נורמלית בפלסמה, עשוי לעבור 50 מוטציות שונות, ואז הוא שוקע בצברים בלב, בריאות ובמעיים וגורם למחלה קטלנית (FAP). כפי שנמצא במדידות קריסטלוגרפיות ע"י שתי קבוצות אחרות, המוטציות הנ"ל לא שינו את הקיפול הנורמלי של החלבון. אך קלי וקבוצתו מצאו שהן שינו את יציבות החלבון, וגרמו ליצירת צורות ביניים מקופלות חלקית שמצטברות זו עם זו, ויוצרות משקעים עמילואידיים.



"התרבות" הפריונים בתאי עצב:





מולקולת פריון פתוגנית נצמדת לנורמלית
ומשרה בה קפול לא נורמלי.

 



 
באפקט דומינו נמשך התהליך עד
שקיעת החלבון בתאים בריכוזים גבוהים


 
(עפ"י פרוסינר)


תופעה דומה נצפתה ע"י רון וונזל, החוקר מחלות עמילואידוזיס של השרשראות הקלות של הנוגדנים. גם כאן מוטציה אחת בלבד, פוגעת ביציבות הקיפול של החלבון, ועושה אותו רגיש יותר לסדור מרחבי שונה המוביל לאגרגציה. בעוד שהמחלות הנ"ל נדירות יחסית ופוגעות באחד מ-100,000-10,000 איש, מחלת אלצהיימר פוגעת בכארבעה מיליון איש בארה"ב בלבד. במחלה זו מופיעים במוח פלקים שמרכזם הוא חלבון עמילואידי המורכב בעיקר מחוטיות חלבון הנקראות עמילואיד ביתא, וכך נגרם הנזק המוחי. עמילואיד ביתא מורכב מ-40 ח"א, נחתך מחלבון גדול יותר הנקרא חלבון מוצא עמילואידי (APP). מוטציה מסוימת בחלבון זה מגבירה את יצירת העמילואיד ביתא שעשויה להוביל לשקיעת החוטיות, מאחר שעליה בריכוז החלבון מגדילה את ההסתברות שצורות מקופלות חלקית יצמדו זו לזו. 

קיפול בלתי נורמלי של חלבון עשוי להיות הגורם לסדרת מחלות יחודיות הנקראות "ספגת המוח" או "מחלות שטיון (סניליות) מדבקות". לסדרה זו שייכות קרויצפלד-יעקב, קורו ואחרות באדם, וכן מחלת "הפרה המשוגעת" וסקרייפי בכבשים. גם כאן יש שקיעה של צורות חוטיות חלבוניות במוח המובילות ליצירת חללים, שטיון ומות, שבדרך כלל מתרחש תוך שנה מהופעת סימני המחלה הראשונים. מחלות אלו כונו מחלות "פריון" ע"י סטנלי פרוזינר (שזכה לאחרונה בפרס וולף). חלבוני הפריון מופיעים בשתי צורות - האחת מקופלת בצורה נכונה, והשניה - בה מופיעות שרשראות החלבון בצורה בלתי נכונה - שוקעות באגרגטים בתאי המוח. מנגנון היוצרות המחלות עדיין אינו ברור, אך התאוריה טוענת, שכשצורה בלתי נורמלית נתקלת בצורה נורמלית, היא גורמת לה להפוך לצורה הבלתי נורמלית גם כן. כך ניתן להסביר איך נגרמת המחלה ע"י הזרקת הצורה הבלתי נורמלית למוחות בעלי חיים.

מוטציה או הפרדה בקפול הנורמלי מובילות לאגרגציה במקום לקפול נכון

הבנת מנגנון יצירת העמילואיד ביתא עשוי להוביל לפתוח שיטות למניעת תהליך זה ולמעשה לריפוי מחלות אלה. חומרים שימנעו את הקיפול הבלתי נורמלי, עשויים למנוע את הצטברות החלבון והתפתחות המחלות. הדרך המוצעת היא למצוא מולקולות קטנות או חלבונים, שיצמדו לצורות הביניים בלבד וימנעו את הידבקותן זו לזו. אכן חברות התרופות מנסות גישה זו, אך עד עתה אין פרסומים בנושא והדרך לפתרון בוודאי עדיין ארוכה.



ציור סכמתי של חלבון הפריון הנורמלי (למעלה) כשהגלילים מדמים שרשראות מקופלות נכון.
עם השינוי לצורת ביתא, מיוצגת על ידי חיצים מתקבל הפריון הפתוגני.


ד"ר איתן ישראלי - המכון למחקר ביולוגי בישראל

פורסם ב"סינתזיס" 13, עמ' 27-26, יוני 1996