חיידקים במגננה - ירון כספי

חיידקים, שלעתים גורמים לנו לחלות, יכולים בעצמם לחלות ואף למות – זאת כשתוקפים אותם נגיפים מיוחדים – ונפוצים ביותר – בקטריופגים ("זוללי חיידקים"). מתברר כי לחיידקים יש מנגנוני הגנה מתוחכמים נגד אויבים זעירים אלה, ושלהם משמעות גם לגבי בריאות האדם

בין השנים 1884 ו-1890 הגדיר רוברט קוך (Koch), הרופא שהיה למיקרוביולוג נודע, ארבעה קווים מנחים המאפשרים לקבוע כי מחלה זיהומית נגרמת על ידי מיקרואורגניזם ספציפי. היה זה סיכומו של אחד הפרקים המרתקים בתולדות הרפואה המודרנית, שהוביל לפיתוחן של פרקטיקות רפואיות אנטי-מחלתיות חדשות, ועקב כך לעלייה משמעותית בתוחלת ובאיכות החיים של המין האנושי. ואולם כמה שנים לאחר שהתקבלה הקביעה כי יצורים מיקרוסקופיים, ובעיקר חיידקים, אחראים למחלות זיהומיות, התברר כי יש גורמי מחלות נוספים הקטנים מהחיידקים הזעירים ביותר, ושאי אפשר לזהותם כגורמי מחלה בעזרת הקווים המנחים של קוך. היה זה האות ליסודו של תחום מדעי חדש - הווירולוגיה - העוסקת בחקר הנגיפים (וירוסים).

כיום אנו מורגלים כל כך להבחנה בין נגיפים לחיידקים עד שאין מי שאינו יודע כי מחלות חיידקיות אפשר לרפא עם אנטיביוטיקה, בעוד שלמחלות נגיפיות כמעט שאין תרופה. הסיבה לכך היא שנגיפים, שלא כמו חיידקים, אינם יכולים לייצר באופן עצמאי את המולקולות האורגניות הדרושות להתרבותם, ולכן קשה למצוא חומרים כימיים שיתקפו ספציפית אותם מבלי לפגוע בגופנו. למעשה, נגיפים הם בסך הכול פיסות של חומצות גרעין (DNA או RNA), המכילות הוראות כיצד ליצור נגיף חדש, ועטופות במעטפת המשמשת למטרות הגנה ולמטרות מסייעות נוספות. כדי להתרבות עושה הנגיף שימוש במנגנונים ביולוגיים של התא המותקף ומייצר בעזרתם את הרכיבים הדרושים ליצירת נגיפים חדשים.

לחיידקים מגוון צורות. יש חיידקים עגולים, מאורכים, חיידקים בצורה מעוקלת הדומה לפסיק, חיידקים בצורת סליל (ספירלה) וצורות רבות אחרות. פעמים רבות שְמו של החיידק מעיד על צורתו, כך למשל, סטרפטוקוקוס פנאומוניה, שגורם לדלקת ריאות, הוא בעל צורה עגולה, כפי שמעיד עליו שמו - קוקוס, מהמילה היוונית kokkos - שמשמעותו גרגיר או גרעין.

נגיפים של חיידקים

מתברר, שנגיפים תוקפים לא רק אנשים, בעלי חיים וצמחים, אלא את כל סוגי היצורים החיים בטבע. נגיפים הקרויים בקטריופגים (bacteriophage), או בקיצור פאג'ים, תוקפים חיידקים והם אחד האיומים הבריאותיים הגדולים ביותר על חייהם. את החיידק המיועד לתקיפה מזהה הפאג' על פי חלבונים ספציפיים, הממוקמים על מעטפת החיידק המותקף ומכונים קולטנים (איור 1). לאחר שנצמד הפאג' לחלבונים אלה הוא מזריק את החומר הגנטי שלו לתוך החיידק. על פי ההוראות שבחומר גנטי זה ובעזרת מנגנוני ייצור החלבונים של החיידק, מיוצרים חלבונים נגיפיים, שמשתתפים בשכפול החומר הגנטי הנגיפי ובייצורם של חלבונים נוספים הדרושים לנגיף. לבסוף, מורכבים הנגיפים החדשים בתהליך המכונה הרכבה ספונטנית, המוביל לפיצוץ המעטפת של החיידק ולשחרורם לסביבה של נגיפים חדשים (זהו מחזור ליטי; מלשון ליזיס, פירוק). T4, אחד הבקטריופגים הקטלניים ביותר לחיידקים שנחקרו, משתק באופן כמעט מיידי את ייצורם של החלבונים החיידקיים ותוך כ-12 דקות יוצר כ-100 נגיפים חדשים. מעניין כי לפאג'ים אחרים אפשרות 'להחליט' לפעול אחרת ולא להרוג את החיידק. במקרה זה, במקום לייצר נגיפים חדשים, עובר ה-DNA של הפאג' אינטגרציה לתוך הכרומוזום של החיידק ונשאר שם במצב רדום עד לזמן מאוחר יותר, שבו 'יחליט' לצאת מהכרומוזום ולהתחיל לייצר נגיפים חדשים. במצב כזה מכונה הפאג' הכלול בכרומוזום החיידקי – פרופאג'. על פי ההערכות, הפאג'ים נפוצים כל כך בטבע עד שאין אף צורה ביולוגית אחרת שקרובה להשתוות אליהם מבחינה מספרית.

איור 1: מחזור חיים של פאג'. בשלב הראשון הפאג' מזהה קולטן הנמצא על גבי המעטפת של החיידק ונצמד אליו. בשלב השני מזריק הפאג' את ה-DNA שלו לתוך החיידק. בשלב השלישי משוכפל ה-DNA של הפאג' ומיוצרים חלבוני המעטפת של הפאג' על ידי מנגנוני שכפול
ה-DNA וייצור החלבונים של החיידק. בשלב האחרון מיוצרים פאג'ים חדשים בתהליך המכונה "הרכבה ספונטנית" שאינו מצריך אנרגיה. עקב כך המעטפת של החיידק מתפוצצת, והפאג'ים החדשים משתחררים ומוכנים להתחיל את מחזור החיים מהתחלה (מחזור ליטי).

מבחינה אקולוגית אפשר לתאר את היחסים בין החיידקים לפאג'ים כמערכת קלאסית של טורף (הנגיפים) ונטרף (החיידקים). יחסי גומלין אלה מובילים ליצירת מנגנוני הגנה אצל הנטרף, שבעזרתם הוא מנסה להתחמק מהתקפותיו של הטורף. החיידקים, שאינם שונים מבחינה זו מכל נטרף אחר, פיתחו כמה מנגנונים כאלה; הפאג'ים פיתחו מנגנונים כדי להתגבר על מערכות ההגנה של החיידקים; החיידקים פיתחו מנגנונים כדי להתגבר על המנגנונים החדשים של הפאג'ים וחוזר חלילה. כך נוצר מרוץ חימוש בין הטורפים לנטרפים.

אחת הדוגמאות היפות לכך הוא ניסיונם של החיידקים להסוות עצמם מפני הפאג'ים. כאמור, הפאג'ים מזהים את החיידקים בעזרת חלבונֵי המעטפת של החיידקים. כדי להסוות את עצמם מייצרים חיידקים מסוימים מערכת חלופית של חלבוני מעטפת. כך למשל, חיידק השעלת יכול להופיע בשני מופעים: (+) ו-(-). ההבדל ביניהם הוא שבמופע ה-(+) מופיעה מערכת של חלבונים על גבי החיידק, שאינם קיימים במופע ה-(-). אחד מאותם החלבונים הוא הקולטן שאליו נצמדים הפאג'ים. לכן החיידקים במופע ה=(-) עמידים פי מיליון להתקפה של פאג'ים מאשר אלה במופע (+). למעשה, מערכת החלבונים הקיימת בחיידק מופע ה-(+) היא שמאפשרת לו להיות פתוגני ולגרום למחלת השעלת. כלומר, החיידק במופע (+) הרוויח את היכולת לנצל את הגוף שלנו אך תוך כדי כך חשף את עצמו למתקפת הפאג'ים.

רוב החיידקים הם קטנים. גודלם לרוב הוא כמה מיקרומטרים. ואולם יש חיידקים ענקיים שיכולים להגיע לגודל של כמה מאות מיקרומטרים, כך שאפשר לראות אותם בעין בלתי מצוידת. החיידק הגדול ביותר המוכּר מגיע לאורך של 0.75 מ"מ (Titanospirillum namibiensis).

דרך אחרת בה משתמשים חיידקים כדי למנוע היקשרות הפאג'ים אליהם היא חסימת הקולטנים. חיידקים מסוימים מייצרים חלבונים המתחברים לקולטן ומונעים באופן פיזי את אפשרות היצמדות הפאג' לחיידק. דרך נוספת להשגת המטרה היא ייצור של שרשרות סוכריות ארוכות על פני החיידק. שרשרות אלו יוצרות הפרעה מרחבית המוֹנעת מהפאג'ים גישה לקולטנים, אך מאפשרות גישה למולקולות קטנות, ולכן שומרות על תפקוד הקולטנים. הפאג'ים לא נשארו חייבים: אצל חלק מהם התפתחו אנזימים מיוחדים על המעטפת, שמפרקים את שרשרות הסוכריות ופותחים גישה מחודשת לקולטנים. פאג'ים אחרים פיתחו אסטרטגיה חלופית: במקום להרוס את שרשרות הסוכריות הם משתמשים בהן כקולטנים חלופיים, נצמדים אליהן ונעזרים בהן לשם הזרקת ה-DNA...

גם לאחר שהזריק הנגיף את החומר התורשתי שלו לחיידק משימתו טרם הושלמה. אצל כרבע מהחיידקים קיים קו הגנה שני, בצורת אנזימי חיתוך, שמזהים רצף מסוים של DNA וחותכים אותו. אנזימים נוספים מזהים DNA חתוך ומפרקים אותו. בצורה זו נפטר החיידק מ-DNA זר שחודר אליו. אלא שהמשימה אינה פשוטה, זאת מכיוון שגם לאורך ה-DNA של החיידק ייתכן שיימצאו אותם רצפים, והחיידק רוצה כמובן לשמור על ה-DNA שלו שלם. כדי להתגבר על בעיה זו מסמן החיידק את ה-DNA העצמי שלו בקבוצות מֶתיל (CH₃), כך שמצד אחד החלבונים ההכרחיים לתפקודו, כמו אלה האחראים לשכפול ה-DNA וגורמי התעתוק שלו, נשארים פעילים, בעוד שאנזימי החיתוך – שאינם חותכים DNA מסומן בקבוצות מֶתיל – אינם גורמים לו נזק.

אצל חלק מהחיידקים קיים מנגנון נוסף המכונה שכפול כושל. במקרה כזה, לאחר שהפאג' החדיר את ה-DNA שלו והתחיל לייצר את החלבונים הדרושים לו, מזהה החיידק את התקיפה ומפעיל מנגנון המוביל להתאבדות החיידק. המקרה הנחקר ביותר של שכפול כושל מבוסס על חלבונים הנצמדים ל-DNA הנגיפי וגורמים עקב היצמדותם לשפעולה של תעלה יונית הנמצאת על מעטפת החיידק. שפעול זה מוביל להקטנת המתח החשמלי בין פְּנים התא לסביבתו ומונֵע את ייצור המולקולות נושאות האנרגיה הכימית של התא (ATP). כתוצאה מכך החיידק מת, הפאג' מאבד את האפשרות להתרבות וייצורם של נגיפים נוספים נפסק. כך מציל החיידק המותקף את חייהם של בני מינו על חשבון הישרדותו שלו. התנהגות זו מעלה כמובן שאלות פילוסופיות על מקומה של האלטרואיסטיות בטבע, ועל הרמה – רמת הגנים, רמת הפרט או רמת המין-הביולוגי – שבה פועלת האבולוציה.

מתברר, שנגיפים תוקפים לא רק אנשים, בעלי חיים וצמחים, אלא את כל סוגי היצורים החיים בטבע. נגיפים הקרויים בקטריופגים (bacteriophage), או בקיצור פאג'ים, תוקפים חיידקים והם אחד האיומים הבריאותיים הגדולים ביותר על חייהם.

קריספר – המערכת החיסונית הנרכשת של החיידקים

למרות שמנגנוני ההגנה שהוזכרו הם מנגנונים יעילים, המאפשרים לחיידקים לשרוד את ניסיונות התקיפה של הפאג'ים, הם חסרים את אחת התכונות היעילות ביותר במניעת התקפה על ידי גורם זר - היכולת לזכור מיהו האויב. בצורה מסוימת המנגנונים שהוזכרו דומים למערכת החיסונית המולדת של בעלי החיים. כשבעל חיים מזהה פלישה של גורם זר הוא מגייס בשלב הראשון תאים מיוחדים, שתפקידם לזהות תאים נגועים ולהרוג אותם. בצורה זו מקריב הגוף מספר קטן של תאים למען בריאותו הכללית. כיום מאמינים המדענים כי המערכת החיסונית המולדת התפתחה בשלב מוקדם מבחינה אבולוציונית, ורק בשלב מאוחר יותר התפתחה אצל בעלי החיים המערכת החיסונית הנרכשת, שפועלת בעזרת נוגדנים: כשבעל חיים נחשף לגורם פולש הוא מפעיל תכנית גנטית, שמטרתה לייצר חלבון חדש - הנוגדן - שלא היה קיים קודם בגוף ושמזהה את הגורם הפולש באופן ספציפי. בפעמים הבאות שיותקף הגוף על ידי אותו פולש כבר יהיה בידו נשק מיוחד כנגד הפולש, שיכול לכוון את תאי המערכת החיסונית ישירות נגדו. זהו כמובן המנגנון שעליו מתבססים החיסונים – תחילה חושפים את הגוף לחיידק או לנגיף מוחלש או מומת, אז מפתח הגוף נוגדנים נגדם, וכך כשהוא נחשף למקור המחלה הוא כבר מוגן. המפתיע הוא שהחיידקים פיתחו מערכת מקבילה, מתוחכמת לא פחות, שמטרתה ללמוד מהניסיון. מערכת זו מכונה קריספר -CRISPR - clustered regularly interspaced short palindromic repeats, או בעברית: חזרות קטעי פָּלִינְדְּרוֹם (פלינדרום הוא רצף של סימנים שיכול להיקרא באותה צורה משמאל לימין או מימין לשמאל, כמו אמא או אבא.) קצרים מקובצים. על פי ההערכות מערכת זו קיימת בקרב כ=40% ממיני החיידקים.

לפאג'ים השפעה ניכרת על התפוצה של חיידקים שונים. הערכות שונות גורסות שבין 20% ל=40% מהחיידקים החיים בים מתים מדי יום עקב התקפות של פאג'ים (יש מי שמטיל ספק בהערכות אלה). מודלים אקולוגים מסוימים מציעים כי פאג'ים תוקפים את החיידקים הנפוצים יותר מאת אלה הנפוצים פחות. בכך הם תורמים תרומה נכבדת לשמירת המגוון הביולוגי של החיידקים. אף שהדבר אינו ודאי, נראה כי האינטראקציה בין הפאג' לחיידק יוצרת לחץ אבולוציוני על החיידקים להקטין את גודלם.

סיפור גילויה של מערכת הקריספר מעיד על המהפך העובר על הביולוגיה העכשווית ועל החשיבות ההולכת וגוברת של שיטות חישוביות לגילוי מנגנונים ביולוגיים חדשים. בשנת 1987 זיהו חוקרים מאוניברסיטת אוסקה ביפן קבוצה של רצפים קצרים החוזרים על עצמם ברצף ה-DNA של החיידק E. coli. במהלך שנות התשעים של המאה שעברה התגלו רצפים דומים ב-DNA של חיידקים רבים נוספים. בין השנים 2002-2000 איחדו חוקרים ספרדים והולנדים את הידע על רצפים אלה מחיידקים שונים וטבעו את המונח קריספר. מכיוון שפעמים רבות בחיידקים גֶנים הקשורים תפקודית שוכנים בסמיכות על רצף ה-DNA, אִפיינו החוקרים גם את האזורים הסמוכים לרצפים החוזרים, וגילו משפחה שלמה של חלבונים המכונה קאס (cas, CRISPR-associated-genes). ואולם אף שהיה ברור שלאתר זה על רצף ה-DNA יש תפקיד, לא היה ברור מהו.

הפתרון הופיע מכיוון לא צפוי: משנות השמונים של המאה הקודמת חלה קפיצת דרך ביכולות לפענח את רצף ה-DNA. בשנת 1984 פוענח לראשונה הרצף השלם של נגיף, ובשנת 1995 פוענח לראשונה הרצף של חיידק שלם. במאגרי המידע החלו להצטבר עוד ועוד רצפים מפוענחים. בשנת 2005, בהסתמך על מאגרי מידע אלה ובעזרת שיטות של ביולוגיה חישובית, גילו שלוש קבוצות מחקר שונות שהרצפים הנמצאים בין הרצפים החוזרים מתאימים במקרים רבים לרצפים מקבילים של פאג'ים, של פרופאג'ים או של אלמנטים גנטים הנודדים בין חיידק לחיידק (אלמנטים גנטיים הנודדים מחיידק לחיידק הם פיסות DNA שעוברות בין הכרומוזומים של חיידקים באופן שאינו תלוי בשכפול הכרומוזום עצמו.). מכאן הסיקו החוקרים כי מערכת הקריספר משמשת כמנגנון הגנה בפני פאג'ים, מסקנה שהתחזקה כשהתברר שחיידקים שהיו בעלי הרצף מתאים לפאג' מסוים היו עמידים, בין היתר, לסוג זה של הפאג'. רק בשנת 2007 התקבל אישוש ניסויי לתיאוריה, כשהתברר שאם בוררים חיידקים שמשמשים ליצירת יוגורט כך שיהיו עמידים לפאג'ים מסוימים, הם רוכשים רצף חדש באתר הקריספר שלהם, שזהה לרצף של הפאג' כלפיו הפכו חסינים. יתר על כן, אם מוסיפים רצף מתאים מתוך פאג' לאתר הקריספר של חיידק בעזרת הנדסה גנטית, הוא הופך חסין לפאג'!

התמונה שהתקבלה היא, אם כן, שמערכת הקריספר-קאס היא מערכת חיסונית נרכשת, בדומה למערכת החיסונית הנרכשת שלנו, והיא משמשת את החיידקים כמנגנון עמידות כנגד פאג'ים. כדי להבין כיצד היא פועלת יש לתאר את המבנה שלה.

תרפיית פאג'ים היא רעיון שעל פיו אפשר להשתמש בפאג'ים ההורגים חיידקים כטיפול אלטרנטיבי לאנטיביוטיקה, בבחינת האויב של אויבי הוא חברי. לצורת טיפול כזו יתרונות רבים: למשל, פאג'ים יכולים לתקוף זנים ספציפיים של חיידקים ולהרוג את גורמי המחלה בלי לפגוע בחיידקים הטובים שבגופנו. חיידקים, כמובן, מפתחים עמידות לפאג'ים, אך אפשר, בקלות יחסית, להתגבר על עמידות זו על ידי ברירה במעבדה של פאג'ים חדשים. אף שהרעיון הוא כבר כמעט בן 100 שנה, הוא כמעט ואינו בשימוש. אחת הסיבות היא שבאחוז מסוים מהחולים המערכת החיסונית מזהה את הפאג' עצמו כפולש, ומפעילה את מערכת החיסון נגדו.

המבנה של מערכת קריספר-קאס

אתר הקריספר בנוי מרצפים קצרים החוזרים אחד אחרי השני, וביניהם ממוקמים רצפים ייחודיים המכונים מרווחים (איור 2). האורך הממוצע של היחידות החוזרות ושל המרווחים הוא עשרות נוקליאוטידים. בסמוך למערך האזורים החוזרים (ולפניו), ממוקם רצף נוסף המכונה הרצף המוביל (leading sequence), שאינו מקודד יצירה של חלבון. משני צדי האתר נמצאים חלבוני הקאס, שמחולקים לשלוש קבוצות: קבוצה של חלבונים השמורים בין חיידקים שונים, קבוצה של חלבונים שאינם שמורים בכל החיידקים, וקבוצה שלישית המכונה "חלבונים מסתוריים הקשורים לרצפים חוזרים".

איור 2: מבנה אתר הקריספר-קאס. דוגמה למבנה אתר קריספר-קאס של החיידק E. coli. באתר מקודדים שמונה חלבונים, חמישה מתוכם מרכיבים את הקאסקיד, שאחראי על עיבוד ה-RNA המתועתק. שלושת החלבונים האחרים משתתפים בפעולות אחרות הדרושות לשם תפקוד המערכת החיסונית של החיידק. ברצף ה-DNA נמצאים לאחר החלבונים הרצף המוביל, ואחריו הרצפים החוזרים והמרווחים.

המבנה של אתר קריספר אינו אקראי. חשיפה לפאג' חדש מובילה להוספת הרצף החוזר והמרווח המתאים תמיד בצד הסמוך לרצף המוביל. כך, הסדר על אתר קריספר מכיל בתוכו למעשה את ההיסטוריה של ההתקפות הנגיפיות על החיידק ועל אבותיו. ואולם אם לוקחים בחשבון את תדירות התקפותיהם של הפאג'ים, מוביל מנגנון זה בהכרח לגידול מסיבי באורך הדנ"א של החיידק, וליצירת עומס חסר תועלת בשכפול DNA מיותר. לפיכך התפתח בחיידקים מנגנון נוסף, שאחראי על מחיקת רצפים ישנים מאתר הקריספר (ממש כמו ביישומי מחשב מסוימים, בהם קבצים חדשים דורסים את הקבצים הישנים).

בנוסף להגדרת הכיווניות של אתר הקריספר, אחראי הרצף המוביל על עצם יכולתה של המערכת החיסונית לתפקד. עדות לכך אפשר למצוא בחיידקים שבהם אתרי הקריספר חסרים את הרצף המוביל. אתרים כאלה הם אתרים מתים – הם אינם מבצעים אינטגרציה של מרווחים חדשים ואינם מעניקים לחיידק הגנה חיסונית חדשה.

מעניין לציין כי לחלק מהחיידקים אתר קריספר יחיד, אך אין זה נדיר למצוא חיידקים בעלי מספר אתרי קריספר שונים. ניתוח השוואתי של אתרים אלה העלה כי הקשר בין רצפים חוזרים או בין רצפים מובילים של חיידקים שונים הוא די קלוש. לעומת זאת, כשלחיידק אחד יש כמה אתרים שונים על הכרומוזום שלו, יכילו אלה בדרך כלל רצפים חוזרים ורצפים מובילים בעלי רצף דומה. המשמעות היא שהמנגנון החיסוני של החיידקים הוא מנגנון גמיש, שאינו תלוי בצורה הדוקה ברצפים ספציפיים של DNA ופועל על סמך עקרונות כלליים יותר. כדי להבין כיצד עקרונות אלה באים לידי ביטוי, יש להבין כיצד המרווחים והרצפים החוזרים מעניקים לחיידק את חסינותו.

חיידקים מבצעים התאבדות מסיבות שונות: לדוגמה, בחיידק Staphylococcus aureus קיים גֶן המוביל את החיידק להרג עצמי ושחרור ה-DNA שלו לסביבה. DNA זה משמש כדבק העוזר לחיידקים האחרים ליצור קרום ביולוגי (biofilm), מבנה המורכב מחיידקים רבים שיוצרים מבנה 'רב תאי' אחד. מבנה זה תורם לשרידותם של החיידקים ששוכנים בו, שכן הוא מקטין את הסיכוי שייטרפו על ידי מיקרואורגניזמים ומגביר את יכולתם  להתגבר על חומרים אנטיביוטיים הנמצאים בסביבה.

המנגנון החיסוני של מערכת הקריספר

כדי להעניק חסינות כנגד פאג', צריכה מערכת הקריספר לבצע שלוש מטלות: תחילה עליה לזהות התקפה של נגיף ולהכניס רצף מסוים מה-DNA שלו לתוך ה-DNA של החיידק; בשלב השני צריכה המערכת להפעיל את המנגנון החיסוני בעקבות תקיפה מחודשת של הפאג'; ובשלב השלישי היא צריכה לנטרל את ההתקפה הנגיפית. נתאר כיצד פועל המנגנון החיסוני הנרכש של החיידקים, אך יש לציין שזהו תיאור חלקי – הידע שלנו עדיין אינו שלם.

מסתבר שכמו מבנה אתר הקריספר, כך גם הרצפים שנבחרים מתוך ה-DNA של הפאג' כדי לשמש כמרווחים אינם אקראיים. אם מנתחים את הרצף של המרווחים ומשווים אותם לרצף של הפאג'ים שמהם נגזרו, מתגלה כי רצפי המרווחים על הפאג' מופיעים תמיד לפני רצפים מיוחדים המכונים "מוטיבים הסמוכים לקדם מרווחים". כמו הרצפים המובילים והרצפים החוזרים, גם הרצף של מוטיבים אלה משתנה מאתר קריספר אחד למשנהו. עובדה זו מרמזת כי הבחירה של המוטיבים, ובעקבותיה הבחירה של רצפי המרווחים, נעשית על ידי חלבונים ייחודיים לכל אתר ואתר. המועמדים הטבעיים לכך הם כמובן חלבוני הקאס. כיום משערים כי שניים מחלבוני הקאס משתתפים בתהליך הזיהוי והאינטגרציה של ה-DNA הנגיפי לתוך ה-DNA החיידקי. קיומם של מערכות קריספר מקבילות בחלק מהחיידקים, מרמזות כי הם פועלות בצורה בלתי תלויה אחת בשנייה.

ככל הנראה, הרצף המוביל משמש כמקדם (Promoter) לתעתוק של חלק נרחב – ולעתים אף של כל – אזור הקריספר למולקולת RNA ארוכה. בשלב הבא נחתך ה-RNA לפיסות קטנות של כמה עשרות נוקליאוטידים, המכונות crRNA, בעזרת קומפלקס של חלבוני קאס. הקומפלקס מכונה קאסקֵיד (Cascade – CRISPR associated complex for antiviral defense). לשם עיבוד ה-RNA עושה הקאסקֵיד שימוש ביכולת של חלק מהחלבונים המרכיבים אותו לפעול כאנזימים החותכים חומצות גרעין. פיסת ה-crRNA המתקבלת מכילה רצף של כשמונה נוקליאוטידים מתוך רצף חוזר אחד, את הרצף המתועתק מהמרווח המתאים, ולבסוף חלק של הרצף המתועתק של הרצף החוזר הבא אחריו (איור 3).

איור 3: פעולתה של מערכת הקריספר-קאס. בשלב הראשון המערכת מזהה DNA זר, מסנתזת מִקטע המתאים ל-DNA  זה, ומכניסה אותו בעזרת חלבוני קאס לתוך אתר הקריספר יחד עם רצף חוזר מתאים. בשלב השני ה-DNA  מתועתק מתוך אתר הקריספר ל-RNA  שעבר עיבוד בעזרת הקאסקֵיד - שהוא קומפלקס של חלבוני קאס - לפיסת crRNA המכילה את הרצף מהמרווח שצמוד ל-RNA  שנגזר מהרצפים החוזרים משני צדיו. בשלב השלישי, ה-crRNA  ביחד עם הקאסקיד וחלבוני קאס מזהה את התקיפה החוזרת של הפאג', נצמד ל-DNA שלו ומוביל להרס ה-DNA הנגיפי

קיומה של מולקולת crRNA היא תנאי הכרחי ליכולתה של מערכת הקריספר להעניק לחיידק עמידות. הוצע שה-crRNA   פועל על ידי היצמדות ל-RNA השליח של הפאג', דבר המוביל להריסת ה-RNA הנגיפי ומונע את יצירת החלבונים הדרושים לפאג' לשם שכפולו. אולם למעשה, מערכת הקריספר פועלת על ה-DNA של הפאג' תוך שהיא נעזרת ב-crRNA בקאסקיד. יחד הם מחפשים ב-DNA של הנגיף את האזור המשלים ל-crRNA. כאשר מזוהה אזור זה, ה-crRNA מסיט את הקשרים בין שני גדילי ה-DNA של הפאג' ונצמד במקום אחד מהגדילים לגדיל ה-DNA המשלים לזה של ה-crRNA. הקומפלקס שנוצר בין ה-crRNA ל-DNA הנגיפי ולחלבוני הקאסקיד מאפשר לקאסקיד לחתוך את ה-DNA של הפאג', מה שמוביל להרס כולל של ה-DNA הנגיפי.

אך כאן צצה ועולה הבעיה שדיברנו עליה קודם: אותו רצף הנמצא ב-DNA של הפאג', נמצא גם באתר הקריספר. לכן החיידק נמצא בסכנה שמערכת הקריספר תזהה בטעות את הכרומוזום של החיידק כ-DNA נגיפי, תחתוך אותו ותביא להרס המטען הגנטי שלו עצמו. כאן מתגלה היופי של עקרונות העיצוב של מנגנון הקריספר: כאמור, משני צדי אזור ה-crRNA המשלים לרצף של ה-DNA הנגיפי ממוקמים אזורים שנגזרו מהרצפים החוזרים של אתר הקריספר. כך, אם מזהה ה-crRNA את אתר הקריספר כאתר אפשרי לחיתוך, ייצמדו לרצף המתאים של ה-DNA של החיידק גם שמונת הנוקליאוטידים הראשונים של ה-crRNA שנגזרו מהרצף החוזר. מבנה זה שונה במידה מספקת מהמבנה המוביל לחיתוך ה-DNA של הפאג' ולכן חלבוני הקאסקיד אינם יכולים לחתוך את הכרומוזום של החיידק. כך משיג החיידק חסינות כנגד הפאג' מבלי לסכן את עצמו.

קבוצת הפאג'ים (the phage group) היא שמה של רשת מדענים שהתאספו סביב זוכה פרס הנובל מאקס דֶלבּרוּק (Delbrück) במחצית השנייה של המאה ה-20. הקבוצה זכתה לשמה בשל השימוש שעשו בפאג'ים ככלי מחקר עיקרי. קבוצה זו הרימה תרומה  נכבדת להתפתחותה של הביולוגיה המולקולרית.

השלכותיה של מערכת הקריספר-קאס

נמצא שיש קשר בין מערכת הקריספר לבין יכולתם של חיידקים לגרום למחלות זיהומיות. קבוצה של חוקרים מאוניברסיטת הארוורד חקרה את קשר זה בחיידק Enterococcus faecalis, הנמצא באופן טבעי במערכת העיכול שלנו. משנות השמונים של המאה שעברה התפתחו זנים חדשים של החיידק, שמהווים את אחד הגורמים המובילים למחלות זיהומיות שמקורן בבתי חולים. במקרים רבים הופכים זיהומים אלה לזיהומים מסכני חיים. זנים אלה מהווים סכנה בריאותית כה חמורה מכיוון שהם רכשו עמידות כנגד מספר רב של תכשירי אנטיביוטיקה, דבר המקשה על היכולת לטפל בהם. בדרך כלל עמידות לאנטיביוטיקה נרכשת על ידי חיידקים בעזרת גורמים כגון פלסמידים הנודדים מחיידק לחיידק (וראו עמידות פרהיסטורית, גל חיימוביץ). מתוך השוואת ה-DNA של הזנים הפתוגנים לאלה שאינם גורמים מחלות, גילו החוקרים כי מקור רבע מה-DNA של הזנים הפתוגנים הוא ב-DNA נודד. בנוסף לעמידות כנגד האנטיביוטיקה, הכילו חלקים אלה של ה-DNA גם גנים רבים המגבירים את הפתוגניות של החיידק.

כאמור, בנוסף להגנה שמעניקה מערכת הקריספר נגד פאג'ים, היא נועדה לטפל באלמנטים נודדים של DNA ובשכיחות שהם עוברים אינטגרציה לתוך ה-DNA של החיידק. ואכן, החוקרים גילו כי הזנים שאחראים לזיהומים בבתי החולים חסרים מערכת קריספר פעילה, בעוד אלה הנמצאים באופן טבעי במערכת העיכול שלנו הם בעלי מערכת כזו. לפיכך, ובהסתמך על "אילן היוחסין" של הזנים הפתוגניים, טוענים החוקרים כי שימוש יתר באנטיביוטיקה בבתי חולים בשנות השבעים הוביל למחיקה של מערכת הקריספר הפעילה מחיידקי Enterococcus faecalis מסוימים, דבר שאִפשר להם לרכוש עמידות למספר רב של אנטיביוטיקות. אם זה נכון, אנו יכולים ללמוד מכך על המשמעויות של שימוש יתר באנטיביוטיקה, ועל חשיבותה של המערכת החיסונית של החיידקים לבריאותנו.

חיידקים נצפו לראשונה על ידי אבי תורת המיקרוביולוגיה אנטוני ואן לוונהוק (Van Leeuwenhoek) באמצע המאה ה=17 בעיר דלפט שבהולנד, באמצעות מיקרוסקופ פשוט (בעל עדשה אחת) שבנה בעצמו. ואן לוונהוק אף ליטש את העדשות בעצמו, והגיע לאיכות כה גבוהה שנדרשו 100 שנים נוספות עד ששוחזרה איכות עדשותיו.

השלכה הנוספת של מערכת הקריספר מעוררת מחשבה מבחינה תיאורטית. לפני שנתיים חגג העולם 150 שנה לפרסום הספר "מוצא המינים", שציין את הולדתה של התיאוריה הדרוויניסטית, התיאוריה האבולוציונית השלטת עד היום. כידוע, דרווין לא היה הראשון שהציע שהמינים קשורים זה לזה בצורה אבולוציונית. 50 שנה קודם לכן טען זאת זאן-בטיסט דה למארק (Jean Baptiste de la Marck). ההבדל בין התיאוריה של למארק לבין זו של דרווין הוא שלמארק טען שתכונות שנרכשות במהלך חייהם של האורגניזמים בצורה הגורמת להם להפוך למותאמים יותר לסביבה, מועברות בתורשה לצאצאיהם ומהוות את הבסיס לשיפורם של המינים-הביולוגיים לאורך ההיסטוריה. התיאוריה של למארק נדחתה על ידי הקהילייה המדעית. במקומה התקבלה הצעתו של דרווין, שעל פיה השונוּת בין יצורים מאותו מין-ביולוגי אינה פרי של שכלול מכוון של תכונותיהם, אלא נוצרת בצורה אקראית. אחת הסיבות המרכזיות שהתיאוריה של למארק אינה יכולה לעבוד היא שתאי המין אינם מושפעים מהדרך בה האורגניזמים חיים את חייהם. כך לדוגמה אם אחד מההורים חלה בשחפת ופיתח כנגדה נוגדן, צאצאיו לא יהיו מחוסנים, שכן ה-DNA המקוֹדד את יצירת הנוגדנים אינו עובר לתאי הרבייה. ואולם, לחיידקים אין תאי רבייה – והם מעבירים לצאצאיהם את ה-DNA היחיד שיש להם. כלומר, כל שינוי ב-DNA שהתרחש במהלך חייהם יועבר לצאצאיהם. בדרך כלל שינויים אלה הם שינויים אקראיים שמתאימים לתיאוריה הדרוויניסטית. אבל במקרה של מערכת הקריספר, השינוי ב-DNA איננו אקראי כלל וכלל. זהו שינוי מכוון, שאותו מבצע החיידק בצורה מבוקרת. יתר על כן, השינוי ב-DNA החיידקי בעקבות החשיפה לפאג' נותן לחיידק יתרון הישרדותי– עמידות כנגד נגיפים – יתרון אותו הוא מעביר לצאצאיו. 

לאור זאת מציעים החוקרים יורי וולף (Wolf) ואוגניה קוונין (Koonin) ממכון המחקר הלאומי לבריאות של ארצות-הברית, לראות במערכת הקריספר מנגנון אבולוציוני למארקיאני, המתקיים במקביל למנגנונים הדרוויניסטים, שאחראיים לרובה של האבולוציה. לתפישה כזאת, אם תתקבל, יכולות להיות השלכות מרחיקות לכת על ההבנה שלנו את ההיסטוריה האבולוציונית, ובעיקר על ההבנה של האבולוציה המוקדמת, שהתרחשה בסמוך להיווצרות החיים.

לקריאה נוספת:

Philippe Horvath and Rodolphe Barrangou, CRISPR/Cas, the Immune System of Bacteria and Archaea Science, 327, 167-170 (2010).

Fedor V. Karginov and Gregory J. Hannon, The CRISPR System: Small RNA-Guided Defense in Bacteria and Archaea, Molecular Cell, 37, 7-19 (2009).

Eugene V. Koonin and Yuri I. Wolf, Is Evolution Darwinian or/and Lamarckian?, Biology Direct, 4 (2009)

Simon J. Labrie, Julie E. Samson and Sylvain Moineau, Bacteriophage resistance mechanisms, Nature Reviews Microbiology, 8, 317-327 (2010).

Kelli L. Palmer and Michael S. Gilmore, Multidrug-Resistant Enterococci Lack CRISPR-cas, mBio, 1 (4), 1-10 (2010).

ירון כספי הוא בעל תואר דוקטור ממכון ויצמן למדע. 

מבצע בימים אלה מחקר בתר דוקטורנטי בביופיזיקה של חיידקים 

במחלקה למדעי הביו-ננו באוניברסיטת דלפט בהולנד.

פורסם בגליליאו 163, מרץ 2012

באדיבות המחבר ומערכת גליליאו