הצד החיובי שבנגיפים - מוניר מוואסי, סברינה חביב, לודמילה מסלנין ומיטל שעשוע

נגיפים הם, כידוע, טפילים שמתרבים בתוך התא ומנצלים אותו לצורכיהם. עיקרו של המחקר המדעי המושקע בנגיפים של צמחים, מכוון להתמודדות עם הנגיפים האלימים. אולם, בשנים האחרונות החלו לחקור דווקא את הנגיפים שאינם אלימים, ולפתח כלים ביוטכנולוגיים המבוססים על השימוש בהם

נגיפים (וירוסים) הם גופיפים תת-מיקרוסקופיים, הנחשבים טפילים מוחלטים, המתרבים רק בתוך תא חי ומנצלים את המערכות הביולוגיות שלו כדי להתקיים, להתרבות ולנוע בתוך הפונדקאי. נגיפים יכולים לנגע מגוון רחב של יצורים, ובכללם בעלי חיים וצמחים. בכתבה זו נתייחס בעיקר לנגיפים המנגעים צמחים.

למרבית נגיפי הצמחים יש מבנה פשוט, הכולל חומצת גרעין עטופה בחלבון מעטפת. חומצת הגרעין של הנגיפים המנגעים צמחים היא לרוב מהסוג RNA חד-גדילי חיובי, כלומר – המסוגל לעבור בתוך התא המאכסן תרגום ליצירת חלבונים בעלי תפקידים ביולוגיים שונים, חשובים להתרבותו ולהישרדותו של הנגיף בצמח הפונדקאי.

נגיפים עלולים לגרום מגוון רחב של מחלות בצמחים, ולהפסדים כלכליים אדירים בחקלאות. אולם ישנם נגיפים, או גזעי נגיפים, אשר יכולים להתקיים ולהתרבות בצמח בלי לגרום לתסמיני מחלה אלימים; אלה הם נגיפים בלתי אלימים. יש גם כאלה שכלל אינם גורמים לתסמיני מחלה (נגיפים סמויים – לָטֶנטיים). עיקרו של המחקר המדעי המושקע בנגיפים של צמחים מכוון בעיקרו לצורכי מלחמה או להתמודדות עם הנגיפים האלימים וטיפוח צמחים עמידים. אולם, בשנים האחרונות אנו עדים להתפתחות כיוון מחקר חדש בתחום הווירולוגיה, העוסק בפיתוח כלים ביוטכנולוגיים, המבוססים על השימוש בנגיפים בלתי אלימים, או סמויים, למטרות חיוביות, כמו פיתוח עמידות נגד פתוגנים שונים (בין אם חרקים המהווים נשאים של מחלות, או נגיפים אחרים המחוללים מחלות קשות), החדרה וביטוי של תרכובות ביולוגיות או חלבונים שונים לצמחים, וכאמצעי לחקר תפקידם של גנים שונים בצמח הנבחן.

התכונות הייחודיות של הנגיפים, כמו היכולת לנצל את המערכות הביולוגיות של התא המאכסן, קצב ההתרבות המהיר והמבנה הפשוט שלהם, אפשרו פיתוח מערכות ביטוי (וֶקטוֹרים) המבוססות על נגיפים; מערכת זו נקראת וירוס-וקטור. הווירוס-וקטור הוא וירוס אשר הגנום שלו עבר שינוי גנטי והוחדר לתוכו גן זר. הוא מתרבה בתוך תאי הצמח הפונדקאי ותוך כדי כך הוא מבטא בין היתר גם את הגן הזר אשר הוחדר לגנום שלו.

התמרת צמחים

לנגיפים צמחיים יש בדרך כלל גנום קטן, המקנה יכולת תמרון קלה והליך הדבקה פשוט יחסית. מסיבה זו וֶקטורים של נגיפים צמחיים משמשים חלופה טובה לשיטה המקובלת - התמרת צמחים (טרנספורמציה), לביטוי גנים זרים בצמחים. בהתמרת צמחים הגן הזר מוחדר באופן קבוע לתוך הכרומוזום של הצמח ומתבטא בכמות נמוכה יחסית, ואילו במערכת הווירוס-וקטור לא חל שינוי גנטי בכרומוזומים של הצמח.

נגיפי המוזאיקה של הכרובית במיקרוסקופ אלקטרונים סורק
מקור

מבחינה טכנית, ניתן להחדיר גן זר, בצורת DNA, לתוך הגנום של הווירוס-וקטור, כאשר גם הוא בצורת DNA. לכן, השימוש הראשוני בנגיפים של צמחים בתור כלי להחדרה ולביטוי של גנים זרים בצמחים החל בשנות השמונים המוקדמות, במערכת המבוססת על גנום נגיף המוזאיקה של הכרובית CaMV, שלו גנום DNA דו גדילי. אבל, במערכת זו הגנום הרֶקוֹמבּיננטי של הנגיף לא תמיד יכול היה להיעטף בחלבון המעטפת, ולכן לא תמיד נוצרו חלקיקי נגיף שלמים. עם התפתחותם של טכנולוגיות חדישות בתחום הביולוגיה המולקולרית, אשר אפשרו תעתוק מולקולות RNA לDNA, אפשר היה לפתח מערכות וירוס-וקטור אחרות, המבוססות על נגיפי RNA, המהווים את מרבית הנגיפים המנגעים צמחים.

אפשר לחלק את מערכות וירוס-וקטור לשלוש קטגוריות: בראשונה, הגן הזר מוחדר לתוך גנום הנגיף כתוספת לגנים הוויראליים (gene insertion). בשנייה, אחד הגנים של הנגיף מוחלף בגן הזר (gene substitution); במקרה זה הגן המוחלף של הנגיף אינו חיוני להתרבות ולהתפשטות הנגיף בצמח. בקטגוריה השלישית, multicomponent system, הגנום של הנגיף מחולק לשני מקטעים (לפעמים יותר): מקטע אחד מכיל את הגנים החיוניים לשכפול הנגיף, והמקטע השני מכיל, בין היתר, את הגן הזר. היתרון בווקטורים כאלה הוא המבנה הפשוט, המאפשר שינויים גנטיים ויכולת תמרון קלה יותר בהחדרת הגן הזר לתוך גנום הנגיף.

מערכות הווירוס-ווקטור הפופולריות ביותר, ושאף והיו מבין הראשונות אשר פותחו בהתחלה, הן אלו המבוססות על נגיף תפוחי האדמה (PVX)  ונגיף המוזאיקה של הטבק (TMV). שני הנגיפים האלה הם בעלי גנום RNA חד-גדילי, ומבטאים את החלבונים שלהם באמצעות פְּרוֹמוֹטוֹרים ספציפיים, כאשר כל פרומוטור אחראי על יצירת RNA שונה המתורגם בהמשך לחלבון נגיפי אחר תוך כדי יצירת RNA המתבטא ליצירת חלק מהחלבונים הנגיפיים. הגנום של הנגיפים האלה הונדס גנטית בצורה שיכיל פרומוטור נגיפי נוסף, אשר באמצעותו אפשר לבטא את הגן הזר המוחדר לגנום הנגיף. 

בדומה לשתי מערכות אלו, פותחו בהמשך מגוון רב של מערכות וירוס-ווקטור, כאלו המבוססות על נגיפים אשר מנגעים בעיקר צמחים עשבוניים ועונתיים. לאחרונה פותחו גם כמה נגיפים המתאימים לגידולים מעוצים ורב שנתיים. נגיף הטריסטזה של ההדר, Citrus tristeza virus, CTV, הוא הנגיף הארוך ביותר מבין הנגיפים הצמחיים, ואורכו מגיע ל-2,000 ננומטר (דומה לגודלו של חיידק קטן) עם גנום של RNA, בגודל כ-20 אלף נוקליאוטידים. קבוצת המחקר בפלורידה של החוקר המוביל בתחום ויליאם דווסון (W.O. Dawson), הצליחה לערוך שינויים גנטיים בגנום נגיף הטריסטזה של ההדר ולפתחו כווקטור שיאפשר ביטוי גנים זרים. נמצא כי הגן הזר היה יציב ונשמר בגנום וקטור ה-CTV לתקופה ארוכה, העולה על תשע  שנים. וקטור ה-CTV משמש לאחרונה גם ככלי ביוטכנולוגי לחקר תוצרי חלבון בעלי פעילות אנטי חיידקית, היכולים לנטרל חיידקים פתוגניים, כמו אלו הגורמים למחלת ההדרים הקשה הידועה בשם גריינינג.

השתקת RNA כהתגוננות בפני נגיפים

באיקריוטים שונים, לרבות צמחים, קיים מנגנון להתגוננות בפני פולשים, כמו RNA זר, נגיפים וטרנספוזונים. המנגנון, הידוע בשם RNA silencing (השתקת RNA) מבוסס על פירוק והרס ספציפי של ה-RNA (הגנום הוויראלי) של הפולש הזר טרם ביטויו בתא הפונדקאי. הגורם העיקרי המשרה את הפעלת המנגנון הוא נוכחות RNA דו גדילי (double-stranded RNA; dsRNA) בתא הפונדקאי.

תחילת תהליך ההשתקה מתרחש בעקבות זיהוי מולקולות RNA דו-גדילי בציטופלזמה של התא על ידי אנזים מַפתח הקרוי DCL (Dicer-like). אנזים זה הוא נוקלאז, אשר חותך את מולקולות ה-RNA הדו-גדילי למולקולות קצרות הנקראות siRNAs (small interfering RNAs). מולקולות ה-siRNA נקשרות לקומפלקס חלבוני המכונֶה RISC (RNA-induced silencing complex) ומובילות אותו להתקשר לRNA הפולש ולבסוף לחתוך אותו למקטעים קטנים חסרי פעילות ביולוגית.

במהלך מחזור החיים של נגיפים צמחיים נוצר RNA דו-גדילי. באופן טבעי, צמחים אינם מכילים RNA דו-גדילי ארוך. נוכחות RNA דו-גדילי ארוך בצמח היא מעין סמן לנוכחות פולש זר, וכאשר מזהה הצמח בתוכו את הRNA הדו-גדילי הוא מפעיל נגדו מערכת השתקת RNA, אשר גורמת לבסוף להרס הגנום של הפולש.

המאפיין את מנגנון ההתגוננות השתקת RNA, הוא שאיננו מוגבל רק לתאים הצמחיים אשר לתוכם פלש הנגיף, אלא שאות ההשתקה מתפשט לתאים אחרים ונע לחלקיו השונים של הצמח. חשוב לציין כי תהליך זה בבסיסו הוא תלוי רצף, כלומר הפירוק של מולקולות ה-RNA איננו אקראי, אלא מכוון ספציפית רק לנגיף הפולש אשר הפעיל את מנגנון השתקת RNA. כדי להתגבר על מנגנון השתקת ה-RNA שהופעל בעקבות הדבקת הצמח בנגיף, מייצר הנגיף חלבון אשר יכול לנטרל את מנגנון השתקת ה-RNA. תהליך זה מכונה דיכוי השתקת RNA (Suppression of RNA silencing). חלבוני הנגיף המדכאים השתקת RNA בדרך כלל מעורבים גם בתפקידים ביולוגיים נוספים, כמו תנועת הנגיף ברקמות הצמח ורבייתו. חשוב לציין כי חלבונים כאלה אינם ייחודיים לנגיפים של צמחים – הם מיוצרים גם על ידי נגיפים המנגעים בעלי חיים.

שימוש בנגיף ככלי ביוטכנולוגי

מאחר שהדבקת הצמח בנגיף גורמת להפעלת מנגנון השתקת RNA, ניצלו חוקרים את היכולת הזו כדי לנצל נגיפים כדי לחקור תפקידים של גנים שונים בצמח, בשיטה הנקראת Virus-induced gene silencing  (VIGS). לפי שיטה זו, מחדירים רצף של  גן צמחי כלשהו, שאותו רוצים לבדוק, או מקטע של הגן,  לתוך גנום של נגיף צמחי. לאחר כך, מדביקים את הנגיף הרֶקומביננטי הנושא את הגן הזר לצמחים. הנגיף מתרבה בתוך הצמח ויוצר תוך כדי ההתרבות RNA דו-גדילי אשר גורם לשפעול המנגנון השתקת RNA הן כנגד הנגיף והן כנגד הגן הצמחי. התוצאה תהיה נטרול הביטוי של הגן הצמחי, וכך אפשר ללמוד על תפקידו הביולוגי בצמח.

שיטת ה-VIGS פותחה לראשונה במין של טבק ולאחר מכן במגוון של מיני צמחים נוספים. השיטה נחשבת היום לאחד הכלים השימושיים ביותר בחקר תפקודי הגנום בצמחים. במעבדה שלנו, במִנהל המחקר החקלאי בבית דגן, הנמנית עם המחלקה לפתולוגיה של צמחים, פותח ווקטור על בסיס הגנום של נגיף הגפן GVA, נגיף המתקיים ברקמת השיפה בצמח, כמו בעורקים. דוגמה לשימוש בווקטור הגפן לחקר תפקוד גנים היא אפיון הגנים ממשפחת DELLA בגפן. חלבוני DELLA מעכבים תגובות בצמח המופעלות על ידי ההורמון הצמחי ג'יברלין (Gibberellin). ההורמון הצמחי ג'יברלין מבקר תהליכים רבים בהתפתחות הצמח, כגון התרחבות עלים והתארכות הגבעול. ביטוי או דיכוי של הגנים ממשפחת ה-DELLA יוצר פנוטיפ שבו אפשר לראות בצמח התרחבות עלים והתארכות הגבעול. מקטעים קצרים של גנים ממשפחת ה-DELLA בגפן הוחדרו לתוך גנום ווקטור הגפן GVA. ואכן, בצמחי גפן אשר הודבקו בווקטור הרקומביננטי נתגלתה התארכות גבעולים אופיינית.

השימוש בנגיפי צמחים למטרת השתקת גנים, VIGS, מתרחב ומיושם ביצורים נוספים. לאחרונה דיווחו חוקרים כי באמצעות הווקטור הנגיפי המבוסס על גנום וירוס המוזאיקה של הטבק אפשר להדביק באופן ישיר פטרייה טפילית ולהשתיק בה את הגנים של הפטרייה. ממצא זה מעיד על הפוטנציאל הטמון בשיטת VIGS ועל אפשרות השימוש בה כשיטה ביוטכנולוגית להתמודדות בפני מחלות פטרייתיות, ע"י השתקת גנים החיוניים להתפתחות הפטרייה.

בעשור האחרון נגיפים רבים הונדסו גנטית ופותחו לווקטורים היכולים לבטא חלבונים בצמחים. בין החלבונים אשר בוטאו בצמחים באמצעות המערכות וירוס-וקטור היו חלבונים בעלי חשיבות רפואיות, כמו נוגדנים חד-שבטיים (מונוקלוניים) ותרכובות חיסון. נוגדנים חד-שבטיים (מונוקלוניים) הם חלבוני מַפתח במערכת החיסון של בעלי חיים. חלבונים אלה מזהים ונקשרים לאנטיגנים באופן ספציפי. נוגדנים חד-שבטיים מזהים וקושרים אתר אחד באנטיגן ולפיכך נחשבים ליותר ספציפיים. הם משמשים למטרות שונות כמו דיאגנוסטיקה, מניעה וטיפול בפני מגוון רב של מחלות. באופן טבעי, ייצור הנוגדנים נעשה בבעלי חיים. אף על פי כן, בשנים האחרונות אנחנו עדים להתפתחות גישה של ייצור נוגדנים באמצעות צמחים, כגון פיתוח צמחים טרנסגניים, אשר בגנום שלהם מושתלים גנים המבטאים נוגדנים חד-שבטיים ספציפיים לפתוגנים של בעלי חיים. בעקבות פיתוח מערכות הווירוס-ווקטור אפשר היום לבטא נוגדנים חד-שבטיים בכמויות יותר גדולות, אפילו מסחריות, ובפרקי זמן קצרים. הכנת נוגדנים מונוקלוניים נגד פתוגן כלשהו בכמויות גדולות בבעלי חיים היא הליך יקר; המערכת הביולוגית, צמח-וירוס-ווקטור, נחשבת לגישה חלופית ואטרקטיבית לייצור מהיר, זול ופשוט של מוצרים בעלי חשיבות תרופתית.

אחת הדוגמאות היא השימוש בווקטור המבוסס על וירוס המוזאיקה של הטבק (TMV) לצורך ביטוי בצמחי טבק של נוגדנים חד-שבטיים, נגד נגיף ה-HIV. בצמחי הטבק, החוקרים הצליחו לקבל נוגדנים נגד נגיף ה-HIV בכמויות של 150 מ"ג לכל ק"ג רקמה צמחית טרייה, וזאת בתוך 5-7 ימים לאחר הדבקת הצמחים בווקטור מוזאיקת הטבק, הנושא בגנום שלו את רצף הגן של הנוגדן. דוגמאות נוספות לשימוש בווקטור מוזאיקת הטבק הן ביטוי נוגדנים חד-שבטיים נגד גורמים מעורבים במחלות סרטן דם (non-Hodgkin's lymphoma) ונוגדנים נגד הקורונו-וירוס TGEV, הפוגע בקיבה ובמעי. מערכות וירוס-וקטור נוספות שימשו בין היתר לייצור נוגדנים נגד נגיפים פתוגניים ומחלות מידבקות קשות ונפוצות, בעיקר במדינות מתפתחות, כמו נגיף הצהבת (Hepatitis B), נגיף האיידס (HIV),  נגיף הפפילומה, הפרוטוזואון גורם המלריה, וחיידקי טטנוס, כולרה, ו-E.coli.   

תרכיבי חיסון

תרכיבי חיסון מכילים אנטיגנים אשר בעת כניסתם לגוף האדם, או בעל החיים, הם גורמים להפעלת מערכת החיסון וליצירת נוגדנים ספציפיים נגדם. לכן, תרכיבי החיסון חיוניים ונחשבים אמצעי יעיל להתמודדות בפני מחלות זיהומיות. התרכיבים מכילים לרוב חיידקים ו/או נגיפים "מתים" או "חיים" אך בלתי אלימים, אם כי לפעמים די בחלבון ספציפי או מקטע של חלבון כדי להשרות יצירת נוגדנים בגוף. על אף חשיבותם הרפואית, ייצור תרכיבי חיסון הוא יקר לאוכלוסיות רבות בעולם, במיוחד במדינות מתפתחות. ייצור תרכיבי חיסון בצמחים מהווה פתרון לייצור בכמויות גדולות ותוך פרקי זמן קצרים. 

כדוגמה, נזכיר יצירת תרכיב החיסון בפני נגיף השפעת. מדי שנה יש ביקוש אדיר לתרכיב החיסון בפני שפעת, ויש צורך בהכנה ובאספקה של כמויות גדולות של התרכיבים על ידי החברות המייצרות אותם. לאחרונה הצליחו חוקרים, תוך שימוש בווקטור נגיף מוזאיקת הטבק לייצר בצמחים חלקיקי נגיף אשר ממעטפת החלבון שלהם בולטת תוספת של פפטיד קצר (אֶפיטוֹפּ) ספציפי לנגיף השפעת. חלקיקי הנגיף הרקומביננטי הופקו בכמויות גדולות מהצמחים המודבקים ושימשו בהמשך להכנת כמויות גדולות של נוגדנים ספציפיים לנגיף. דוגמה נוספת היא ייצור בצמחי טבק, של החלבון האנטיגני VP1 של נגיף הפה והטלפיים, וזאת באמצעות ווקטור ה-TMV. העכברים אשר קיבלו את האנטיגן המיוצר בצמח היו חסינים בפני מחלת הפה והטלפיים. בעקבות זה, גדל השימוש בצמחים ובמערכות וירוס-ווקטור למטרת ייצור תרכובות חיסון למחלות בבני אדם ובחיות, לשימוש, בין היתר, נגד מחלות זיהומיות, אלרגיה וסרטן. 

נוסף על ביטוי מוצרים בעלי אופי תרופתי, נעשו לאחרונה מחקרים שבהם שימש נגיף צמחי כווקטור לביטוי פפטידים, מסומנים בתרכובת זוהרת (פלואורסצנטית), המסוגלים להיצמד לתאים סרטניים; באמצעות הפפטיד הפלואורסצנטי אפשר היה לגלות ולעקוב אחר התפרצות תאים סרטניים.

לסיכום

ביטוי וייצור תרכובות תרופתיות באמצעות מערכות וירוס-וקטור היא אסטרטגיה מעניינת, היכולה לתת פתרון לאספקת תרכובות תרופתיות במדינות מתפתחות. בשל טבעם של צמחים בעלי קצב צימוח מוגבר ושל הנגיפים המתרבים ונעים בצמח ומאכלסים אותו בכמויות גדולות, אפשר לייצר בפרק זמן קצרים, ובעלויות נמוכות יחסית, כמויות מסחריות של תרכובות תרופתיות חשובות. 

ד"ר מוניר מוואסי הוא חוקר ומנהל המחלקה לפתולוגיה של צמחים במכון וולקני. עוסק במחלות וירוסים של גפן, הדרים ועצי פרי. המעבדה של דר' מוואסי מבצעת מגוון מחקרים מדעיים למטרות פיתוח כלים לדיאגנוסטיקה של מחלות וירוסים בצמחים, כלים להחדרת וביטוי גנים בצמחים, לפיתוח צמחים עמידים בפני מחלות נגיפיות, וחקר תפקוד גנים נגיפיים ומעורבותם במחלות.

ד"ר סברינה חביב ולודמילה מסלנין הן עוזרות מחקר, האחראיות על ביצוע הניסויים במעבדה.

מיטל שעשוע היא סטודנטית לתואר מוסמך, בהנחיית ד"ר מוואסי; חלק ניכר מעבודת המחקר שלה, הקשור לנגיף ה-GVA, נכלל בכתבה זו.

להרחבה:

Dawson WO., Folimonova SY. 2013. Virus-based transient expression vectors for woody crops: a new frontier for vector design and use. Annual Review of Phytopathology 51,321-337.

Hefferon K. 2013. Plant-derived pharmaceuticals for the developing world. Biotechnology Journal 8,1193-1202.

Hefferon K. 2014. Plant virus expression vector development: new perspectives. BioMed Research International Article ID 785382, 6 pages.

פורסם ב"גליליאו" 199 (אפריל 2015)