יום שישי, 18 באפריל 2008

על קרומי חיידקים וכיצד להילחם בהם - דינה וולודרסקי


חומרים הפוגעים בקרומי חיידקים - תרופות של העידן הבא?

במשך שנים רבות התייחסו החוקרים לחיידקים כאל יצורים יחידאיים, המתרבים בלא תלות זה בזה. קו מחשבה זה התבסס, בין היתר, על תצפיות שנערכו על חיידקים הגדלים באופן חופשי בתמיסה, מצב שאינו מאפיין את תנאי מחייתם בטבע. ואולם, בשנים האחרונות הסתבר כי החיידקים מתקיימים גם בצורות מורכבות יותר. את המונח "ביופילם", המציין קרום ביולוגי הצמוד למשטח קשיח, טבע בשנות השבעים של המאה ה-20 המיקרוביולוג ויליאם קוסטרטון (Costerton) מאוניברסיטת מונטנה, אשר הבחין כי רוב החיידקים החיים על סלעים בפלגי מים מאורגנים במבנה קרומי רב-תאי. מעניין לציין, כי כבר במהלך המאה ה-17 הבחין בביופילם החוקר אנטוני וון לוונהוק (Leeuwenhoek), אשר בנה מיקרוסקופ אור והצליח להבחין בקרום חיידקים בחומר שגירד משיניו, אף על פי שלא הבין זאת בזמנו.

המחקר המתקדם של המבנים הקרומיים הרב-תאיים של החיידקים התאפשר רק בשלהי שנות השמונים, בעקבות התפתחויות בתחומי הביולוגיה המולקולרית והמיקרוסקופיה. התברר כי הביופילמים אינם רק מרבדי חיידקים על גבי משטחים קשיחים, אלא מערכות ביולוגיות מורכבות ודינמיות, והתנהגותו של כל חיידק שונה בתוך הקרום ומחוצה לו. חיידק המצטרף לחיים בקרום משנה את התנהגותו בהתאם; הוא כבר אינו יחידאי ושינויים רבים חלים בו: דופן התא משתנה כך שיתפתחו כוחות תאחיזה בין החיידק לבין המשטח שאליו הוא מחובר, מתרחשת ירידה ברמת הביטוי של חלבונים אשר אינם נדרשים לחיים בקרום (כגון חלבונים האחראים ליכולת התנועה של החיידק), ומנגד - מתרחשת עלייה בביטוי חלבונים אחרים. חלבונים אלה אחראים, למשל, לתקשורת עם החיידקים השכנים וליצירת חומר רב-סוכרי המופרש אל מחוץ לחיידקים, מגן עליהם ומאפשר את בניית הקרום.

קרומי חיידקים ומחלות
אחת התכונות המובהקות בצורת הגדילה כקרום היא העמידות המוגברת של החיידקים בקרום להרג, בהשוואה לחיידקים חופשיים. כתוצאה מכך, ביופילמים הם מקור מרכזי לזיהומים. מכון הבריאות הלאומי האמריקני, ה-NIH, העריך לאחרונה כי מעל ל-60% מהמחלות החיידקיות המטופלות בבתי-החולים בארצות-הברית נגרמות על-ידי קרומי חיידקים המתפתחים על התקנים רפואיים או בגוף החולה, ולא על-ידי חיידקים חופשיים. כיום ידוע כי רוב המחלות החיידקיות הכרוניות (אשר אינן ניתנות לטיפול אנטיביוטי) נגרמות כתוצאה מהתפתחות קרומי חיידקים.

זה המצב במקרה של סיסטיק פיברוזיס (Cystic Fibrosis, CF); זוהי מחלה תורשתית קשה הגורמת לכך שחלבון, המתפקד כנשא המעביר יוני כלור אל התא ומחוצה לו, פגום ואינו מבצע את עבודתו. חלבון זה אמור לתפקד, בין היתר, בתאי הדפנות הפנימיות של הריאות ודרכי הנשימה. כאשר הנשא פגום או כלל אינו נוצר, הריר המרפד את הריאות וכלי הנשימה אינו מכיל די מלח, ולכן אינו סופג די מים והוא צמיג, בניגוד לריר המימי המופרש באנשים בריאים. בעוד שהריר המימי באנשים בריאים מקל את סילוק החיידקים, הריר הסמיך מהווה כר נוח להתפתחות חיידקים וליצירת ביופילמים.

החיידק Pseudomonas aeruginosa הוא אחד הגורמים העיקריים היוצרים ביופילמים ברֵיאות של חולי סיסטיק פיברוזיס. מערכת החיסון של החולה מנסה להיאבק בחיידקים שיצרו ביופילם, אך בלא הצלחה, ונוצרת במקום דלקת כרונית, שאף מחמירה את המצב. דלקת כרונית זו היא המביאה בסופו של דבר להידרדרות במצב הריאות ולמותם של חולי סיסטיק פיברוזיס.

דוגמה אחרת היא זיהומים על גבי התקנים רפואיים (כדוגמת קתטרים, קוצבי לב, מִפרקים מלאכותיים וצנתרים), אשר אף הם נגרמים לרוב על-ידי ביופילמים של החיידק P. aeruginosa וחיידקים אחרים. השימוש המוגבר בהתקנים אלו, והעובדה שהם מהווים משטח נוח להתפתחות ביופילמים, הם גורם חשוב בעלייה בזיהומי ביופילם בבתי-החולים.

החיידק P. aeruginosa אחראי גם לצרות נוספות: דלקות עיניים הקשורות לשימוש בעדשות מגע וזיהום של כוויות. גם העששת, מחלה ששמה נישא בפי כל, נגרמת כתוצאה מביופילמים של חיידקים על השיניים.

תמונת מיקרוסקופ אלקטרוני: ביופילם של Pseudomonas aeruginosa שהתפתח על גבי קתטר
השלבים ביצירת הביופילם

תהליך יצירת ביופילם מתחיל כשחיידקים יחידים נצמדים באופן חלש והפיך אל המשטח הקשיח. בהמשך, ההיצמדות הופכת חזקה יותר ובלתי הפיכה, החיידקים מפרישים חומר חוץ-תאי פולימרי, וחיידקים נוספים - שלא יכלו להיצמד למשטח מלכתחילה - נצמדים לחיידקים ה"ותיקים" בקרום או לחומר החוץ-תאי. הקרום גדל בהדרגה, הן על-ידי צירוף חיידקים חדשים והן על-ידי התרבות של החיידקים הקיימים, עד לקבלת ביופילם בוגר. בסופו של דבר, חלק מהתאים-הצאצאים משתחררים מהקרום ויכולים להתחיל ביצירת קרום חדש באתר אחר.

משמאל לימין: קישור הפיך לפני השטח; היצמדות חזקה יותר ובלתי הפיכה; הפרשת חומר חוץ-תאי פולימרי והבשלת הביופילם;
שחרור תאים מהקרום

"לא טוב היות החיידק לבדו", או מדוע יוצרים החיידקים קרומים?
מהם, לדידו של החיידק, היתרונות שביצירת ביופילמים ובהיצמדות למשטחים, שהופכים את תופעת הביופילמים לנפוצה כל-כך? ראשית, המשטחים הקשיחים והארגון של הביופילם מאפשרים יציבות מסוימת ומספקים הגנה מתנאים סביבתיים קשים, כגון חשיפה לרעלים וחומרים אנטיביוטיים. שכבת הסוכרים שמפרישים החיידקים בקרום מגנה עליהם מפני חלק מהחומרים המסוכנים עבורם, והשכבות החיצוניות של הקרום מגנות על השכבות הפנימיות יותר. נוסף על כך, בתוך הביופילם ישנן מובלעות של חיידקים רדומים, המהווים מעין גיבוי ומבטיחים יכולת שיקום של הביופילם בעקבות פגיעה בחיידקים הפעילים (רוב החומרים האנטיביוטיים יעילים כנגד חיידקים פעילים בלבד, מאחר שהאנטיביוטיקה פוגעת באחד ההליכים החיוניים לפעילותו או להתרבותו של החיידק). לאחר טיפול אנטיביוטי, החיידקים השורדים מנצלים את החיידקים שנפגעו כחומרי מזון ומשקמים את הביופילם שניזוק. גם ב"עתות שלום", כאשר הביופילם אינו פגוע, נפוצים מצבים שבהם מין אחד של חיידקים ניזון מתוצרי הפסולת של מין אחר בתוך הקרום.

דבר אלי ב-homoserine lactones, או: חשיבותה של התקשורת בין חיידקים
תופעה חברתית נוספת שהתגלתה בחיידקים, וחשובה להתפתחות ביופילמים, היא יכולתם לתקשר זה עם זה ולתאם את פעילותם. חלק מהחיידקים מפרישים לסביבתם הקרובה acyl homoserine lactones (AHLs), המשמשים כמולקולות איתות. אם החיידק נמצא בסביבה שאין בה חיידקים אחרים, הרי שריכוזם של חומרים אלו יהיה נמוך. לעומת זאת, אם החיידק מצוי בסביבה רווית חיידקים, המפרישים גם הם מולקולות AHLs, ריכוז החומרים יעלה. החומרים יוכלו לחדור לחיידק ולגרום לביטוי גנים ספציפיים.

מולקולות ה-AHLs מאפשרות לחיידק לחוש, שיש בסביבתו מספר גדול של חיידקים. תופעה זו מכונה חישת הקוורום - Quorum sensing (וראו "החיים הקרומיים של החיידקים", "גליליאו" 101). מנגנון זה מווסת את ביטוים של גורמי אלימות בחיידקים וכן את המעבר ממצב יחידאי למצב הקרומי, על-ידי הפעלת גנים האחראים לחלבונים ההכרחיים לחיים קרומיים.

החשיבות של חישת הקוורום להתפתחות ביופילם הביאה לחיפוש מולקולות בלתי פעילות הדומות ל-AHLs, אשר יכולות לשמש כחומר "אנטי-ביופילמי" משום שהן נקשרות לקולטנים של מולקולות האיתות האמיתיות, אך אינן מעבירות את האות הנחוץ. החוקרים סטפן קיילברג (Kjelleberg) ופיטר שטיינברג (Steinberg) מאוניברסיטת ניו סאות' ויילס באוסטרליה מצאו כי האצה האדומית Delisia pulchra מייצרת חומרים הדומים למולקולות AHLs, המפריעים ליצירת הקרומים החיידקיים ומגנים בדרך זו על האצה. גם עאדל ג'בור (Jabbour), תלמיד דוקטורט שעבד בהדרכתם של פרופ' מוריס סרבניק (Srebnik) מבית הספר לרוקחות ושל פרופ' דורון שטיינברג (Steinberg) מהפקולטה לרפואת שיניים באוניברסיטה העברית בירושלים, הצליח לייצר תרכובות כימיות הדומות למולקולות התקשורת הטבעיות ויכולות לשבש את התקשורת בין החיידקים.

חיידקים, קרומים, ברזל ומה שביניהם...
בשנת 2002 התפרסם בכתב-העת המדעי Nature מאמר של פרדיפ סינג (Singh) וצוותו מאוניברסיטת איווה, שבו דיווחו החוקרים שהחלבון לקטופרין (Lactoferrin), הנמצא בריכוזים גבוהים בחלב אם, בדמעות ובהפרשות של דרכי הנשימה, פוגע ביכולתו של החיידק P. aeruginosa ליצור ביופילמים. נמצא כי היכולת של החלבון לקטופרין לספוח אליו ברזל חופשי, ועל-ידי כך למנוע מהחיידקים לעשות שימוש בברזל, היא המונעת את היווצרות הביופילמים. החוקרים הצביעו על האפשרות שברזל משמש כאות חיוני לצורך יצירת הקרום החיידקי, ומתפקד כמתג למעבר ממצב יחידאי למצב קרומי.

ד"ר אהוד בנין מהפקולטה למדעי החיים על שם מינה ואוורד גודמן והמרכז לחומרים מתקדמים וננוטכנולוגיה באוניברסיטת בר-אילן חוקר את תפקידי הברזל ביצירת הקרום החיידקי, ומשתמש בחיידק P. aeruginosa כאורגניזם מודל. בנין הראה כי סף מסוים של ברזל תוך-תאי חיוני ליצירת הביופילם. דיפוזיה פשוטה של ברזל אינה מספיקה כדי להגיע לסף הדרוש, ועל החיידקים להשתמש בנשאי ברזל, הנקשרים לקולטנים על פני התא, המכניסים פנימה את הקומפלקס תוך השקעת אנרגיה. מכיוון שברזל ממלא תפקיד כה חשוב בהתפתחות הביופילמים, פגיעה ביכולתם של החיידקים לספוג את הברזל עשויה למנוע או לעכב את יצירת הקרום החיידקי.

ד"ר בנין הראה כי החומר EDTA, הסופח יונים מתכתיים דו-ערכיים (ולכן - גם ברזל), פוגע בביופילמים. כאשר משתמשים ב-EDTA יחד עם האנטיביוטיקה ג'נטמיצין (gentamicin), הביופילם מושמד כליל.

תמונת מיקרוסקופ קונפוקלי: תמונה של ביופילם של P. aeruginosa לאחר טיפול ב-EDTA. הצבע האדום הוא סמן לתאים מתים,
ואילו הצבע הירוק הוא סמן לתאים חיים. אפשר לראות כי רוב הביופילם הושמד. יתר על כן, התאים שבמרכז הביופילם,
שברוב המקרים מראים עמידות מוגברת להרג, הם אלו שהושמדו.
שיטה אחרת, שפותחה בשיתוף עם פרופ' מרדכי חביון (Chevion), פרופ' אייל בנין (Banin) מהאוניברסיטה העברית ופרופ' פיטר גרינברג (Greenberg) מאוניברסיטת וושינגטון, היא שיטת ה"סוס הטרויאני", אשר נועדה להקטין את כמות הברזל התוך-תאי ולפגוע ביצירת הביופילם. הסוס הטרויאני הוא נשא שהחיידקים משתמשים בו באופן טבעי לקליטת ברזל, אך במקום ברזל, נושא הנשא יון רעיל לחיידקים, וכך החיידק "מרומה" ומקבל רעל במקום ברזל. בנין ועמיתיו הראו כי שיטת הסוס הטרויאני יעילה לטיפול בביופילם של החיידק P. aeruginosa במצבים שבהם הטיפול האנטיביוטי נכשל. את יעילותה של השיטה הדגימו החוקרים בארנבות שלקו בדלקת של חיידק זה בקרנית העין. טיפול משולב בשיטת הסוס הטרויאני ובאנטיביוטיקה הצליח לפגוע בחיידקים פגיעה ניכרת. כעת נותר להעריך את היכולת של החיידק לפתח עמידות כנגד הטיפול החדש.

ד"ר בנין עוסק בחיפוש אחר חומרים אחרים, שיוכלו גם הם לעכב את התפתחות קרומי החיידקים או לפגוע בקרומים קיימים. לשם כך פנה אל הטבע. הנחת היסוד היא, שבמהלך האבולוציה נאלצו צורות החיים השונות בטבע להתמודד עם התיישבות חיידקים ולמנוע אותה בצורה יעילה. לכן קיים סיכוי רב לאתר חומרים הפוגעים בביופילמים באזורים שבהם היינו מצפים להתפתחות קרומים חיידקיים, אך התפתחות זו מעוכבת. בנין וקבוצתו סבורים, שיש סיכוי סביר למצוא חומרים מונעי התיישבות חיידקים בחומרי טבע מהסביבה הימית (דוגמת אלה שמפרישה האצה האדומית), ובצמחי תבלין מסוימים.

העין היא דוגמה נוספת למקור אפשרי לזיהוי חומרים חדשים המעכבים התיישבות חיידקים. העין חשופה באופן תמידי לחיידקים גורמי מחלות, ובכל זאת, זיהומים בעין הם נדירים יחסית. מכיוון שבקרנית אין כמעט כלי דם, יכולתה של מערכת החיסון בה מוגבלת. נוזל הדמעות משמש כהגנה הראשונית, באמצעות מרכיבים המפריעים להיווצרות קרומי חיידקים.

קרומים ביולוגיים: הטוב, הרע והסוס הטרויאני

ד"ר אהוד בנין, אורגניזם המודל העיקרי שאתה משתמש בו במחקריך הוא החיידק P. aeruginosa. מדוע בחרת דווקא בו?
למעשה, זהו החיידק המועדף כאורגניזם מודל בקרב רוב חוקרי הביופילמים. מדובר בחיידק נפוץ מאוד בסביבה, שאפשר לבודד אותו מדגימות אדמה ומצמחים. זהו פתוגן אופורטוניסטי, כלומר רק לעתים נדירות גורם למחלה באנשים בריאים, אך מסוכן לאנשים שמערכת החיסון שלהם מוחלשת. החיידק הוא גורם מרכזי בהתפתחות זיהומי ביופילם בבתי-חולים, ולכן הוא בעל חשיבות קלינית רבה.


מבחינה מחקרית זהו חיידק מעניין ביותר, מכיוון שיכולת ההסתגלות שלו לסביבה שבה הוא נמצא היא גבוהה מאוד. החיידק נוטה לעבור שינויים רבים בהתאם לסביבה שבה הוא חי, וכך מצליח לשרוד בסביבות שונות. התברר כי אם נוטלים לאורך שנים אחדות דגימות של החיידק מאותו חולה, ובודקים את הרצף הגנומי שלו, מוצאים שינויים המשפרים את שרידותו במאכסן.



מחקרך מתמקד בברזל כמצרך חיוני ליצירת הביופילם. האם יש קשר בין הצורך בברזל לבין חישת הקוורום (Quorum sensing), שכבר הוכח כי היא הכרחית ליצירת הביופילם?

אכן, מצאנו קשר בין כמות הברזל בסביבה לבין חישת הקוורום. מערכת חישת הקוורום בהחלט מושפעת מהתנאים הסביבתיים, וביניהם ריכוז הברזל. כאשר ישנם תנאים של הרעבה לברזל, מתחוללת עלייה ביצירת האותות של חישת הקוורום. בדקנו זאת על-ידי גידול חיידקים בסביבות בעלות ריכוזים שונים של ברזל והפקה וכימות של ה-AHLs - שהם האותות של חישת הקוורום - מתוך המצע שבו גדלו החיידקים. הקשר בין ברזל לתקשורת בין חיידקים פותח פן מחקרי חדש, הקושר שני מנגנוני בקרה חשובים ביותר להתפתחות הביופילם ומדגים כי חישת הקוורום אינה תלויה אך ורק בצפיפות החיידקים אלא גם בגורמים מטבוליים.


אילו יתרונות יש לטיפולים ה"אנטי-ביופילמיים" לעומת הטיפולים האנטיביוטיים המוכרים לנו?

הרעיון הכללי הוא לזהות תהליכים חיונים לביופילם, אשר יכולים לשמש אתרי מטרה לטיפול. כך, לדוגמה, המחקר הבסיסי שלנו, שהצביע על חשיבות הברזל בהתפתחות הביופילם והביא לפיתוח הסוס הטרויאני. דוגמה נוספת היא פיתוח של חומרים מונעי תקשורת בין חיידקים. זוהי כעין "מלחמה אלקטרונית". כאשר מפריעים לתקשורת בין החיידקים, מקבלים החלשה של הביופילם ומקנים יתרון למערכת החיסון שלנו. מצד אחר, העובדה שלא הורגים את החיידקים באופן ישיר מורידה באופן משמעותי את הלחץ הסלקטיבי של החיידקים לפתח עמידות.


האם הפתרונות שאתה מציע, כגון שיטת הסוס הטרויאני והשימוש בסופח היונים EDTA, אינם מסוכנים לבני-אדם?

השיקול הוא תמיד עלות מול תועלת. גם לחומרים האנטיביוטיים, שכולנו משתמשים בהם, עלולות להיות תופעות לוואי שליליות. לגבי שיטת הסוס הטרויאני: שני החומרים שנעשה בהם שימוש הם תרופות מוכרות (כל אחד לחוד), ובריכוזים שבהם אנו משתמשים לא צפויות תופעות לוואי. בניסוי בארנבות לא נראו השלכות מזיקות. עם זאת, החומר עדיין רחוק מלהיות משווק ועליו לעבור את אישור מנהל המזון והתרופות האמריקני (FDA).


מה תרצה להוסיף לסיום?

אף שאני מתמקד בדרכים לפגוע בביופילמים, יש לזכור שבמקרים רבים הקרומים החיידקיים משמשים לטובתו של האדם, למשל לטיהור שפכים, לניקוי פסולת מסוכנת וכפילטרים ביולוגיים.


לגבי הלוחמה בביופילמים, אני חושב שאנו נמצאים בתקופה שבה יש הן האפשרות (ההתפתחויות הטכנולוגיות והשיטות שהזכרתי) והן הצורך (בעיית העמידות לחומרים אנטיביוטיים) לחקור את הנושא. ההשלכות הרפואיות שיכולות להיות להבנת מנגנוני הקרומים החיידקיים הן בעלות חשיבות רבה אם ברצוננו לתת מענה לבעיה זו.



לקריאה נוספת

אתר של אוניברסיטת מונטנה, ובו קטעי וידיאו המתארים היווצרות והתפתחות של ביופילמים:

Hall-Stoodley,L., J.W, Costerton, and P.Stoodley. 2004. Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases. Nature Reviews 2:95-108.



פורסם ב"גליליאו" גיליון 116, עמ' 68-64, אפריל 2008

אין תגובות:

פרסום תגובה